艾滋病检测技术规范（2009修订版）(8)

全国艾滋病检测技术规范

第三章 HIV-1抗原检测

1 范围

本章规定了HIV-1P24抗原检测的方法和用途。 适用于对人血液标本和病毒培养上清液中HIV-1P24抗原的检测。

2 规范性引用文件

NIAID，Virology Manual for HIV Laboratory, NIH Publication,No.97-3828, Jan 1997

3 HIV－1P24抗原检测的意义

3.1 HIV-1感染窗口期、HIV抗体不确定或HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断。 3.2 第四代HIV检测试剂的阳性结果的辅助诊断。 3.3 监测病程进展或抗病毒治疗效果。 3.4 HIV分离培养，病毒复制状况的监测。

4 实验室要求

同HIV抗体检测。

5 检测方法及程序

5.1 试剂：抗体夹心ELISA方法，应使用经国家药品监督管理局批准注册的试剂。 5.2 样品：血清、血浆或病毒培养上清液。 5.3 定性检测 5.3.1 筛选试验

按照试剂盒说明书提供的标准判断有反应或无反应。 5.3.2 确证试验

是P24抗原的中和试验，用于排除筛选试验的假阳性。待检样品先与中和剂（P24 抗原的抗体）共同孵育，如果样品中存在P24抗原，中和抗体将与之结合形成复合物，而不能与固相载体上的捕获抗体结合。然后，用这样处理过的样品重复筛选实验的步骤，同时做一孔未中和的原始样品对照，将中和与未中和孔的OD值进行比较，如果中和孔的OD值下降50 % 以上，认为样品中的P24 抗原是真正的阳性；如果中和孔没有出现OD值的下降，认为P24抗原的反应性可能是假阳性，需要做RNA检测或随访做进一步确证。 5.4 定量检测

将 P24抗原的标准物质稀释成包含0.0和125pg/ml 二个浓度在内的六个不同浓度的系列标准，进行检测。以横坐标为P24抗原的浓度（pg/ml ），纵坐标为OD值，绘制出标准曲线。测出

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未知标本的OD值以后，在标准曲线上查出抗原的浓度。如果未知标本的OD值超出标准曲线上最高抗原浓度的OD值，则需用正常人血清将标本稀释以后再行检测。 5.5 结果报告和解释

5.5.1 HIV-1 P24抗原筛选试验有反应的标本必须经过中和试验确证以后才能判断阳性或阴性。 5.5.2 HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染的辅助诊断依据，不能据此确诊。 5.5.3 HIV-1 P24抗原阴性结果不能排除HIV感染。

5.5.4 监测病程进展或抗病毒治疗效果应进行HIV-1 P24抗原的定量检测。

6 质量保证和质量控制

6.1 检验人员应接受过HIV-1P24抗原检测的技术培训。

6.2 定性检测时，内部对照应满足试剂盒规定的条件，还可以使用含有中等浓度HIV-1P24抗原的质控品（血浆或病毒培养上清液）作为外部对照，按照常规的质控方法，绘制质控图，进行外部质控。中和试验应使用试剂盒提供的中和抗体，适用已知P24抗原阳性的样品作为阳性对照，阳性对照的中和孔，OD值应下降50%以上。

6.3 定量检测时，0.0和125pg/ml二个浓度的OD值应在试剂盒说明书规定的范围内。

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第四章 HIV核酸检测

1 范围

本章规定了HIV核酸定性和定量检测（病毒载量）的意义、实验室要求、检测方法、质量控制及结果判定标准，适用于HIV-1核酸的定性检测和病毒载量的测定。

2 规范性引用文件

卫生部关于印发《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》的通知（卫医发[2002]第10号） Butcher A, Spadoro J: Using PCR for detection of HIV-1 Infection. Clin Imm Newsletter, 1992，12:73－76.

http://www.niaid.nih.gov/daids/vir_manual/full_vir_manual.pdf

Guidelines for the Use of Antiretroviral HIV-Infected Adults and Adolescents MMWR Recommendations and Reports April 24, 1998/47（RR-5）; 42-82.

Bayer HIV-1 RNA3.0 Assay （bDNA） Operation manual Rev.2006-07 Roche AMPLICOR HIV MONITOR? TEST Procedure Manual,version 1.5 Nuclisens ? EasyQHIV-1 Operation Manual, V1.0-2, 2002-05

Fractions of HIV-1 Seropositive Persons by Two Nucleic Acid Amplification Assays, AIDS Research and Human Retrovirus 1993，9:259-265.

《HIV-1病毒载量测定及质量保证指南（试行）》 （（中国疾病预防控制中心，2008年2月）

3 核酸检测的意义 3.1 早期诊断

婴儿的早期诊断：HIV感染母亲所生小于 18个月龄的婴儿，不同时间的两次HIV核酸检测均为阳性即可作出诊断。18个月龄以上儿童诊断与成人相同：有急性HIV感染综合症或流行病学史，且不同时间的两次HIV核酸检测结果均为阳性，即可诊断。

也可使用多样品集合的方法，对采供血机构的原料血浆以及HIV抗体阴性的高危人群样品进行集合核酸检测，及时发现窗口期感染，降低“残余危险度”，减少二代传播。 3.2 疑难样本的辅助诊断

在一般情况下，HIV抗体检测足以对HIV感染与否做出正确诊断，但在特殊情况下，单纯HIV抗体检测结果不能进行明确的诊断，如在感染早期或疾病终末期出现抗体不确定反应时，RNA的测定结果可帮助提供HIV感染早期或终末期的证据。由于试剂的灵敏度、接受有效的抗病毒治疗后以及存在长期低水平病毒的少数感染者等原因，应对其它检测数据和样品背景情况进行综合判断。

3.3 遗传变异监测

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可用于HIV分子流行病学监测，包括HIV-1和HIV-2感染的鉴别诊断、HIV感染传播链的分析、HIV基因亚型和重组病毒的鉴定和分析以及人群HIV遗传变异趋势的监测。 3.4 耐药性监测

可用于HIV耐药检测和监测，指导公共卫生医生了解耐药性病毒株流行的态势和指导临床医生判断抗病毒治疗效果和修改抗病毒治疗方案。 3.5 病程监控及预测

HIV感染发生后病毒载量变化具有一定规律，这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。因此定期进行病毒载量检测有助于确定疾病发展的阶段，以确定相应的治疗方案。

HIV病毒载量与6年发病率的关系为：病毒载量<500c/ml时发病率为5.4%；501～3，000c/ml

时为16.6%，3，001～10，000c/ml时为31.7%；10，001～30，000c/ml时为55.2%；>30，000c/ml时则为80%。当HIV感染者CD4+T细胞计数＜200/μl时，病毒载量与3～6个月发展至AIDS的危险为：病毒载量＜10，000c/ml时发病率为4.9%；10，000～29，999c/ml时为12.7%；30，000～99，990c/ml时为17.7%；＞100，000c/ml时为22.4%。 3.6 指导抗病毒治疗及疗效判定

通常在病毒载量达到一定水平后（如>35，000～50，000c/ml）抗病毒治疗才显示良好的治疗效果。治疗后，通过病毒水平的检测能够确定治疗是否有效。通常在治疗6个月后病毒水平降低0.5 log以上才被认为临床有效。

4 HIV核酸检测实验室要求

HIV核酸检测应在合适的实验室中进行，应建立与实验和实验室管理相关的标准操作指导书和制定严格的管理制度，工作人员必须充分了解各项规定并严格遵照执行。 4.1 实验室分区和功能

实验室应设置两个独立的工作区域：核酸扩增前区和核酸扩增后区。核酸扩增前区包 括试剂准备区和样品处理区，设在不同房间或区域；核酸扩增后区包括扩增区和扩增产物分析区，设在不同的房间或区域。各区的功能是：

4.1.1 试剂准备区：扩增试剂的储备、配制和分装。

4.1.2 样品处理区：样品登记、处理和分装；核酸提取、保存和使用，PCR扩增的第一轮加样。 4.1.3 扩增区：核酸扩增。如果在此区进行套式PCR的第二轮加样，应在PCR防护罩内进行。 4.1.4 扩增产物分析区：扩增产物的电泳、杂交、成像、序列测定、结果分析、登记及报告。

在满足下列要求的前提下，核酸扩增前区或核酸扩增后区可设在一个房间内：

4.1.4.1 核酸扩增前区实验室内设置两个不同位置的实验区，试剂配置在超净工作台中操作，样品处理在生物安全柜内操作。

4.1.4.2 在核酸扩增后区使用全封闭的扩增和检测系统时，如实时荧光PCR仪等。 4.1.4.3 每个实验人员使用各自的试剂、耗材、移液器和盛放污染物的盛器。 4.1.4.4 在实验前后对操作区域和共享器具进行清洁及消毒。

4.1.4.5 各区域的试剂、器具、仪器和设备为该区专用，不得交叉使用。

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4.2 实验室人员和要求

进行HIV核酸检测的人员须具有艾滋病检测实验室的上岗资格，接受过省级以上的实验操作技术及艾滋病实验室生物安全培训及厂家的培训。 4.3 实验室设施和设备

4.3.1 根据检测项目配备相应的设施和设备。

4.3.2 各区域的设施和设备为专用，应根据实验要求在相应区域配置。

4.3.3 试剂准备区：配置冰箱、超净工作台、普通离心机、加样器、振荡器、废弃物容器、可移动紫外灯。

4.3.4 样品处理区：配置-80℃冰箱、生物安全柜、高速制冷离心机、加样器、振荡器、制冰器或制冷模块、恒温水浴或干浴、上下水设备、废弃物容器、紫外灯。

4.3.5 扩增区：配置核酸扩增仪、普通冰箱、无层流PCR操作柜或超净工作台、微型离心机、加样器、废弃物容器、紫外灯。

4.3.6 扩增产物分析区：配置电泳仪、电泳槽、加样器、紫外透射仪、摄影/像设备、普通冰箱、普通离心机、恒温水浴、微波炉、上下水设备、废弃物容器、紫外灯等。测序仪可安置在其他专门实验区。

4.3.7 各区域应使用专用或一次性工作服、帽子、口罩鞋套及袖套，配备防紫外线眼镜。 4.4 实验室生物安全

必须符合艾滋病实验室的通用生物安全要求。 4.5 防止实验室核酸残余（Carry-over）污染措施 4.5.1 严格执行实验室分区制度。

4.5.2 各区域只用于特定的操作，不得从事其它工作。 4.5.3 仪器和材料的专用制度

仪器、设备、材料、设施均应按工作区域进行标识，不得交叉混用。 4.5.4 单向工作流向制度

4.5.4.1 实验室的气流应从扩增前区流向扩增后区，不得逆向流动。建议扩增前区保持弱正压状态，扩增后区保持弱负压状态。

4.5.4.2 实验人员单向工作流向应该为：试剂准备区→样品处理区→扩增区→扩增产物分析区，不得逆向流动。原则上实验人员在扩增后区工作后当天不能再返回扩增前区工作。

4.5.4.3 实验用品单向工作流向应该为：试剂准备区→样品处理区→扩增区→扩增产物分析区，不得逆向流动。实验用品包括实验材料（试剂、样品和扩增产物）、实验器材（容器、板架、实验服、帽子、口罩、手套、鞋套）、办公用品（记录纸、笔等）、以及清洁材料等。 4.5.5 实验室防止核酸残余污染的处理程序

4.5.5.1 实验前将70%乙醇或0.1～1%次氯酸钠溶液或涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦净。

4.5.5.2 实验前移入所需的试剂、耗材、样品以及盛放污染物的盛器。

4.5.5.3 用于定性与定量核酸检测的所有试剂、耗材、移液器等必须分开使用。实验结束后取

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