艾滋病检测技术规范（2009修订版）(10)

全国艾滋病检测技术规范

个月再次检测呈阳性反应，尽快再次采集血样本进行检测。第三份血样本检测呈阳性反应，报告“婴儿HIV感染早期诊断检测结果阳性”；若第三份血样本检测呈阴性反应，报告“婴儿HIV感染早期诊断检测结果阴性”；分别按照前述流程提供相应服务。

5.4.2.4 不同时间“婴儿HIV感染早期诊断”检测均呈阴性反应的喂哺母乳的儿童，应在完全停止喂哺母乳后的6周和3个月（若6周时检测结果为阳性可尽快）再次采血进行核酸定性检测，进行早期诊断。儿童满18个月后则可直接进行抗体检测。

5.4.2.5 如果婴儿第一次采血时已满3个月，但未满12个月，则应尽快在不同时间采集两份血样本；同时将两份血样本送检，按照前述流程进行检测。如果儿童第一次采血时已满12个月，则应首先按照“艾滋病感染产妇所生儿童HIV抗体检测流程”（ 图4）进行HIV抗体检测。若两种不同原理或厂家生产的HIV抗体检测试剂检测结果均为阴性，则排除儿童感染；若HIV抗体检测试剂检测结果呈阳性反应，不能通过抗体检测确定儿童感染状态，则可在不同时间采集两份血样本，按照前述流程进行“婴儿HIV感染早期诊断”检测。如果儿童第一次采血时已满18个月，则应按照HIV抗体检测流程（图1）进行HIV抗体检测，无需进行“婴儿HIV感染早期诊断”检测。

HIV感染产妇所生婴儿出生后6周采集第一份血样本（可制备成滤纸片干血斑（DBS），或EDTA抗凝全血），送检呈阳性反应呈阴性反应尽快采集第二份血样本，送检呈阳性反应呈阴性反应继续随访婴儿满3个月，再次采集血样本，送检呈阳性反应呈阴性反应呈阳性反应报告阳性尽快再次采集血样本，送检呈阴性反应报告阴性 图6 艾滋病感染产妇所生儿童HIV感染早期诊断检测流程

6 质量保证和质量控制

质量控制要考虑从样品接收到发出报告整个过程每个环节的管理过程，包括：（1）人员；（2）实验室分区和环境；（3）仪器；（4）检测过程（试剂、操作过程，外部质控品使用）。

所有相关检验人员需经操作培训，能独立熟练地操作，并经考核合格，持证上岗。 6.1 实验室分区和环境

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HIV-1病毒载量检测实验室原则上应分为三个独立工作区：试剂准备区、样品处理区、扩增产物分析区，并设在不同房间。严格要求三区的空气流向：从试剂准备区到样品处理区，然后到扩增产物分析区，不能逆向流动。 6.2 仪器设备质量控制

加样器、温湿度计须经计量部门校准，每年一次；HIV-1病毒载量检测仪、实时荧光PCR仪、离心机可以委托公司校准，每年一次。冰箱、水浴箱用校准合格的温度计测量温度，并做好记录。 6.3 检测过程质量控制

保证所有试剂盒有效并经国家食品药品监督管理局注册，使用无DNA和RNA酶的水；严格执行仪器和试剂的标准操作程序（SOP），不得擅自修改。每次实验需同时使用试剂盒内的外部质控品以及一个HIV-1 RNA为5000～15000拷贝/毫升的外部外部质控品；每次实验按照试剂盒说明书的要求使用试剂盒提供的外部质控品，并满足外部质控品的要求。 6.4 外部质量控制

国家艾滋病参比实验室每年组织两次病毒载量的能力验证项目，每次5个样品，具体解释详见本规范第九章。

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第五章 HIV-1耐药检测

1 范围

本章规定了HIV-1耐药基因型检测的实验室条件、方法、结果判定及质量控制,适用于血浆、血清和滤纸干血斑样品的HIV-1耐药基因型测定。

2 规范性引用文件

Antiretroviral drug resistance testing in adult HIV-1 infection: 2008 recommendations of an International AIDS Society-USA panel. Clin Infect Dis 47（2）: 266-85.

Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1-Infected Adults and Adolescents. DHHS 2008; Available at: http://AIDSInfo.nih.gov/guidelines.

Update of the Drug Resistance Mutations in HIV-1: Spring 2008, Top HIV Med. 2008;16（1）: 62-68.

3 HIV-1耐药检测的意义 3.1 耐药监测

用于HIV-1感染人群和抗病毒治疗人群的耐药性监测和检测。用于新近感染人群的耐药性监测，了解耐药毒株流行的情况，并采取防控措施，用于治疗前人群的监测，指导制定一线抗病毒治疗方案；用于抗病毒治疗人群的耐药性监测，进行HIV-1耐药发生、发展趋势以及影响因素的分析，指导和完善大规模公共卫生模式抗病毒治疗的程序，以及制定二线治疗方案。 3.2 耐药检测

用于个体患者的耐药检测。在抗病毒治疗前进行耐药检测，可指导临床医生制定抗病毒治疗方案，保证抗病毒治疗的效果；在抗病毒治疗过程中进行耐药检测，可指导临床医生分析治疗失败的原因，并制定补救治疗方案。

4 HIV-1耐药检测实验室要求 4.1 实验室功能分区

实验室原则上应分为4个独立工作区：试剂准备区、样品处理区、扩增区、扩增产物分析区，并设在不同房间。前两区为扩增前区，后两区为扩增后区。见第四章“HIV核酸检测”。 4.2 人员

进行HIV-1耐药基因型检测的人员须具有艾滋病检测实验室的上岗资格，接受过省级以上艾滋病实验室生物安全培训，须具有国家级实验操作技术培训合格证。 4.3 设施和设备

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根据检测项目配备相应的设施和设备。见第四章“HIV核酸检测”，其中扩增产物分析区增加测序仪等设备。

HIV-1耐药基因型检测实验室应制定严格的管理制度，工作人员必须充分了解各项规定并严格遵照执行。见第四章“HIV核酸检测”。

5 HIV-1耐药检测方法及程序 5.1 方法

5.1.1 HIV-1耐药检测的方法可分为两大类，一类是基因型检测法，另一类是表型检测法。HIV-1耐药基因型检测法基于对耐药相关基因突变的检测，利用耐药基因型解释系统判断是否耐药以及耐药的程度；HIV-1耐药表型检测法基于体外培养技术，通过检测抑制病毒生长所需的药物浓度（IC50或IC90），并与参考株进行比较，判断病毒对药物的敏感程度。常用的HIV-1耐药检测方法为基因型检测法，其优势在于周期短、操作简便、重复性好，且花费较少。本章主要介绍HIV-1耐药基因型检测方法。

5.1.2 通常使用逆转录PCR（RT-PCR）和测序方法，商品化试剂盒一般采用一轮PCR扩增，实验室自建（In-house）方法一般使用套式PCR方法两轮扩增。 5.2 试剂 5.2.1 引物

应根据所测目的基因的序列设计，包括RT、PCR和测序引物。可使用商品化试剂盒配套的引物，也可根据参考文献和HIV-1流行毒株的序列自行设计引物。

根据《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册（第二版）》，目前临床上常用的药物有三大类，分别为：蛋白酶抑制剂（PIs）、核苷类或核苷酸类逆转录酶抑制剂（NRTIs）和非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）。针对这三类药物，耐药基因型检测需扩增HIV-1的 pol基因区，目的基因片段应覆盖蛋白酶区4-99位氨基酸和逆转录酶区38-320位氨基酸的基因区域。 5.2.2 主要试剂

实验室自建方法需配置病毒核酸提取、逆转录、PCR和测序反应等步骤所需的试剂。商品化试剂盒使用其配套的试剂。 5.3 扩增目的基因片段及测序 5.3.1 样品的采集和处理

要求感染者血浆病毒载量≥1000拷贝/毫升或国际单位。采用血浆、血清或滤纸干血斑样本，见第一章“样品的采集和处理”。 5.3.2 核酸提取

按照核酸提取试剂盒说明书操作。提取RNA时应注意防止RNA降解。DNA于-20℃保存，RNA和需长期保存的DNA应在-80℃保存。 5.3.3 逆转录反应和PCR扩增

将RNA模板、逆转录引物、dNTP、逆转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液和适量无RNA酶的超纯水加入反应管中，在适宜温度下进行逆转录反应，合成cDNA。将模板（DNA或cDNA）、dNTP、引

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物、缓冲液、Taq酶和适量灭菌纯水加入反应管中，置于扩增仪上，按照设定的程序进行PCR扩增。建议使用RT-PCR一步法试剂进行第一轮扩增反应。 5.3.4 序列测定

通常采用Sanger法进行DNA测序。将扩增产物、dNTP、ddNTP、测序引物、缓冲液、Taq酶和适量灭菌纯水加入反应管中，置于扩增仪上，按照设定的程序进行测序反应，在测序仪中读取序列数据。

5.4 耐药分析和结果报告 5.4.1 耐药分析

5.4.1.1 将所测序列与数据库中的参考序列或共享序列进行比较，判断是否出现耐药相关的基因突变，并根据HIV-1耐药基因型解释系统的规则来评判对特定药物的耐药程度。 5.4.1.2 HIV-1耐药基因型解释系统

提供HIV-1耐药基因型检测数据分析和解释系统（HIVDRDB）的主要机构有：国际艾滋病协会（IAS，http://www.iasusa.org），美国斯坦福大学（HIVDB，http://hivdb.stanford.edu），法国国家艾滋病研究署（ANRS，http://www.hivfrenchresistance.org/index.html），和比利时Leuven大学Rega医学研究所（REGA，http://www.kuleuven.ac.be/rega/cev/）。实验室自建方法通常使用HIVDB系统，商业化试剂盒则使用与试剂盒配套的HIV-1耐药基因型检测数据分析和解释系统。

5.4.2 检测结果的分析解释 5.4.2.1 耐药相关的基因突变

应分基因区报告耐药相关的基因突变，如将蛋白酶（PRO）和逆转录酶（RT）两个基因区的基因突变分开报告（见附表8）。基因突变以“字母－数字－字母”的书写方式来表示，第一个字母代表野生型病毒株特定密码子处的氨基酸，第二个字母代表在特定密码子处替换了的氨基酸。 5.4.2.2 耐药程度分析

各种HIV-1耐药基因型解释系统对耐药程度的划分不同：HIVDB系统分为敏感（S）、潜在耐药（P）、低度耐药（L）、中度耐药（I）和高度耐药（H）五个水平；Rega、ANRS和商品化试剂盒所采用的系统则分为敏感（S）、可能耐药（I）和显示耐药（R）三个水平。

5.4.2.3 当耐药毒株在个体内病毒群体中的比例低于10～20%时，通常检测不到其存在。因此，当在HIVDB、Rega或ANRS系统中报告为“S”，只可报告本次实验结果为“未发现耐药”，不可报告为“敏感”。

6 质量保证与质量控制

质量保证的目的是持续为监测及检测提供准确可靠的检测结果。 包括从样品接收到发出检测报告的全过程。详见本规范第九章。质量控制包括室内质量控制（室内质控）和外部质量控制（外部质控）。 6.1 室内质控

6.1.1 检测过程质量控制

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