格尔德霉素基因工程高产菌株的构建和培养(4)

在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid, AHBA)的生物合成基因簇, 根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因簇负责格尔德霉素(geldanamycin, Gdm)起始

18 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech January 25, 2008 Vol.24 No.1

图3 pGEX-shn基因阻断载体的构建

Fig. 3 Construction of the gene disruption vector pGEX-shn

单克隆分离, 根据对Tsr和Am抗性表型, 筛选获得对ΔSOPAmRTsrS同源基因双交换阻断突变株ΔSOP。阻断变株在基因整合水平进行了PCR验证。以原株和ΔSOP变株的基因组为模板, 选取构建基因阻断载体的1和2片段两翼外测序列所设计引物(P5和

P6)进行PCR, 结果见图4。

由图4可见原株基因组PCR产物大小约4 kb左右, 而在ΔSOP变株中扩增出将近6 kb的特异性条带, 揭示在靶基因之间插入了1.5 kb左右的Am抗性基因, 符合预期结果。ΔSOP变株在不加药传代中AmR表型很稳定, 说明该变株中确实发生了DNA同源重组双交换所造成的AmR基因插入, 并使shn SOP基因受到破坏。

图4 基因阻断变株PCR产物电泳图

Fig. 4 Electrophoresis of PCR products of gene disruption

mutant genome

1: S. hygroscopicus 17997; 2: ΔSOP mutant; M1: λDNA/Hind Ⅲ

marker; M2: DNA marker Ⅲ

2.3 ΔSOP变株发酵产量的HPLC检测

吸水链霉菌17997及ΔSOP变株在固体培养基上培养7d, 将孢子收集后经发酵培养，发酵液离心, 取5 μL发酵液直接进样, 采用甲醇: 水=40%~100% 梯度洗脱30 min, 选择波长304 nm进行HPLC检测,结果见图5。

从峰面积来看, ΔSOP变株发酵液中Gdm的含量要比17997原株的高185%。说明阻断shn SOP基因可以提高菌株的Gdm产量。

2.4 ΔSOP变株在固体培养基上的生长周期与发酵产量的关系

根据孢子形成过程考察了吸水链霉菌17997和

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