格尔德霉素基因工程高产菌株的构建和培养(3)

在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid, AHBA)的生物合成基因簇, 根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因簇负责格尔德霉素(geldanamycin, Gdm)起始

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(25 μmol/L) 各0.5 μL, Template 1 μL, dNTP (2.5 mmol/L) 3.2 μL, Taq 酶 0.2 μL)。反应条件: 仪器40℃预热 1 min, 96℃预解链 2 min, 解链96℃×40 s, 退火60℃×40 s, 延伸72℃×1.5 min, 30个循环, 72℃延伸5 min, 结束反应。

P5上游引物: 5′GTTACGA3′(Xba I) P6下游引物: 5′GAAAGTAGCG3′(Xba I)

1.10 孢子生长周期的观察和计数

将甘油保存菌种接种到平皿上, 28℃培养7 d, 用3 mL无菌水洗下, 取0.1 mL涂布含20 mL培养基的平皿, 28℃培养5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 d, 观察孢子生长情况, 并分别以5 mL无菌水用玻璃珠滚下孢子、打碎、过滤, 孢子液经适当稀释后, 取0.1 mL加入平皿中涂布均匀, 置28℃培养7 d, 根据单菌落计算其孢子数。

1.6 大肠杆菌ET1567/pUZ8002与链霉菌进行接合转移

按文献[15]操作。 1.7 Gdm基因阻断工程菌发酵培养及产物HPLC分析

按文献[7]进行。

1.8 基因阻断载体的构建

根据shnSOP基因序列设计引物, 以吸水链霉菌 17997基因组为模板进行PCR。

上游引物: P1 5′

-CCGGAATTCACACTCGCAC GTCCAGCC-3′带有EcoRI 酶切位点

下游引物: P2 5′-GCGGGTACCGCAGCCAG ATGCAGTCGG-3′带有Kpn I 酶切位点

扩增 1257 bp片段1。

上游引物: P3 5′-AAAACTGCAGCTGTGGCT CAGACTGCTGC-3′带有Pst I酶切位点

下游引物: P4 5′-CTAGTCTAGATGATGTCGG AAAGTAGCG-3′带有Xba I酶切位点

扩增 1265 bp 片段2。

回收PCR产物片段1和2, 在其中间以Pst I－Kpn I酶切位点插入Am抗性基因(1.5 kb), 并以EcoR I-Xba I酶切位点与载体pGH112相应酶切位点进行连接, 转化大肠杆菌DH5α, 获得基因阻断载体。

2 结果

2.1 萘醌型AHBA基因阻断重组质粒的构建

AHBA是安莎类抗生素生物合成的起始单位, 在吸水链霉菌17997中曾发现了两种AHBA生物合成基因簇[AHBA-gdn和AHBA-shn], AHBA-shn基因簇结构见(图2), 前者参与Gdm的生物合成, 后者与吸水链霉菌17997可能产生的萘醌类抗生素有关。为了阻断AHBA-shn的合成, 采用pGH112载体构建了AHBA-shn基因簇中部分基因敲除的重组质粒。应用同源基因重组原理根据ShnS的N端(引物P1)和ShnO的C端(引物P2), 以及ShnO的C端(引物P3)和ShnP的N端(引物P4), 以吸水链霉菌17997总DNA为模板进行PCR, 分别获得了同源片段S1和S2。在片段S1和S2中间加入选择性标记Am抗性基因, 并与载体pGH112相连。基因阻断重组载体pGEX-shn构建流程如图3所示。

1.9 基因阻断株的获得及鉴定

基因阻断株的筛选按文献[16]进行。基因阻断株的PCR鉴定, 选取构建基因阻断载体的1和2两翼外测序列设计引物, 以原株和变株的基因组为模板进行PCR。

2.2 基因阻断株的获得和鉴定

将构建的基因阻断重组质粒pGEX-shn通过大肠杆菌ET12567/pUZ8002接合转移导入到吸水链霉菌17997中, 并在MY培养基中传3~4代后, 再进行

图2 AHBA-shn基因簇的组成

Fig. 2 The organization of AHBA-shn gene cluster

shnQ: aminodehydroquinate synthase gene, shnS: AHBA synthase gene

shnO: oxidoreductase gene, shnP: phosphatase

shnK: kinase gene, shnJ: aminodehydroquinate dehydratase gene

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