格尔德霉素基因工程高产菌株的构建和培养(2)

在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid, AHBA)的生物合成基因簇, 根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因簇负责格尔德霉素(geldanamycin, Gdm)起始

16 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech January 25, 2008 Vol.24 No.1

用基因阻断技术破坏参与萘醌型安莎类化合物的AHBA基因, 以便通过阻断或减少通往合成萘醌型安莎类化合物前体(N-AHBA)量, 增强Gdm前体(B-AHBA)供应代谢流提高其发酵产量。此外, Gdm产生菌属于吸水链霉菌, 这种类型的菌种在固体培养基上经培养其孢子丝将自溶形成吸水褐黑色湿斑, 本研究拟阐明所构建的基因阻断工程菌在固体培养基上的生长周期与发酵产量的关系。

1 材料和方法

图1 格尔德霉素的化学结构

Fig. 1 Chemical structure of geldanamycin

1.1 菌种和质粒

Gdm产生菌——吸水链霉菌17997为本所从土壤中分离得到并保存。大肠杆菌/链霉菌接合转移质粒pGH112 (tsrR 硫链丝菌素抗性) [12]。大肠杆菌/链霉菌接合转移供体菌[13], 大肠杆菌DH5α, 本室保存。阿泊拉抗性基因(Apramycin, AmR)构建在pUC18质粒上, 本室构建。

肿瘤和抗病毒等多种生物活性。Sasaki等最先发现Gdm具有抗原虫和抗肿瘤作用[1], 本所的研究发现Gdm还具有良好的抗病毒活性[2]。近年的研究表明Gdm的这些生物学活性是因为它能特异性地抑制热休克蛋白90 (Hsp90)的ATP/ADP结构域[3,4], 下调多种Hsp90的靶蛋白功能所致。Gdm新颖的作用机制决定了对其深入研究具有潜在的科学与经济价值。低毒、高效Gdm衍生物的获得成为当今新药研究的一个主要目标。目前对Gdm所进行的比较成功的化学改造，主要集中在苯核(17位)上所连接甲氧基的变换。两个在Gdm C17位进行取代的衍生物17-AAG和17-DMAG已在美国进行II期和I期临床实验

[5, 6]

1.2 培养基

吸水链霉菌17997固体培养基(MY)(Yeast ex-tract 4 g, Malt extract 10 g, Glucose 4 g, 琼脂 15 g, 加水至 1000 mL)。Gdm发酵培养基 (starch 2 g, cotton meal 0.5 g, glucose 0.5 g, corn starch liquor 0.5 g,

大肠yeast powder 0.5 g, CaCO3 0.2 g, 加水至100 mL)。杆菌/链霉菌接合转移培养基 (soybean powder 20 g, mannitol 20 g, agar 15 g, 加水至1000 mL)。

。

1.3 药品和试剂

限制性内切酶、LA-Taq酶、连接酶、去磷酸化酶 (CIAP) 均购自TaKaRa公司。DNA回收采用北京鼎国生物技术有限公司的DNA快速纯化/回收试剂盒。引物合成由赛百胜公司完成。硫链丝菌素为美国Squibb & Sons, INC 产品, 阿泊拉霉素(Am)为沈阳药科大学夏焕章教授惠赠。

利用生物技术实现对Gdm产生菌染色体的改造, 对提高Gdm发酵产量和研制化学方法难以获得的衍生物有重要意义。为此首先需要从产生菌中克隆Gdm生物合成的相关基因。本实验室曾根据参与Gdm生物合成的起始单位AHBA

[8, 9]

[7]

合酶基因的

保守区域设计兼并引物, 从Gdm产生菌基因文库中发现并获得了两组AHBA生物合成基因簇及与之连锁的部分PKS基因片段, 通过基因阻断实验鉴定了参与Gdm 生物合成的基因簇[10]。基因同源性分析表明, 另一组AHBA生物合成基因簇(AHBA-shn)与萘醌型的同源性高于苯醌型基因簇, 提示该产生菌中含有编码萘醌型安莎类抗生素的生物合成基因簇。抗生素生物合成中前体的供应往往是发酵产量的限制因素[11]。鉴于苯醌和萘醌型两种安莎类化合物共享AHBA为生物合成的起始单元, 本研究拟采

1.4 仪器

Shimadzu LC-10Avp高压液相色谱仪, SPD- M10AvP二极管阵列检测器, CLASS-VP工作站。PCR仪Techgene Thermal Cycler -PROGENE型。

1.5 DNA操作

大肠杆菌中质粒的提取和转化按文献[14]进行,链霉菌DNA操作按文献[15]进行。质粒的酶切、回收和连接按TaKaRa的说明书操作。PCR反应: PCR反应采用TaKaRa LA-Taq酶, GC-I体系(20 μL): (ddH2O 4.6 μL, GC-I buffer (2×) 10.0 μL, Primer

百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说教育文库格尔德霉素基因工程高产菌株的构建和培养(2)在线全文阅读。