分子生物学实验

分子生物学实验报告

一.实验内容

1.基因组的获取 DNA/RNA的提取和电泳 2.将基因组进行PCR扩增,电泳 3.将DNA电泳片断切胶回收

4.扩增,回收后进行连接载体 （PMD18 puc18 载体）A.B片断比例1:2 5.转化 连接的片断转化到感受态细菌中

二.实验目的

1.基因组的获取:掌握最常用的提取基因的方法，了解琼脂糖电泳的基本原理，掌握基本的操作方法

2.PCR过程:了解反转录PCR(RT-PCR)的基本原理,并掌握RT-PCR的基本操作过程 3.切胶回收:了解分离纯化DNA片段中的污染物方法和原理

4.连接载体:学习提取基因工程菌中运载基因的载体，掌握最常用的体躯质粒DNA的方法 5.转化: 以质粒转化感受态细胞为例，学习转化的基本原理及方法

6.主要目的：通过掌握质粒的提取、RNA的提取、RT-PCR技术、琼脂糖凝胶电泳以及胶回收、DNA的转化和酶切等实验，将这些实验连成一片，掌握一套验证目的基因功能的流程。

三.实验原理

1.基因组的获取 ①DNA提取

本实验采用 碱裂解法 进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（ SDS SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。

用SDS 处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA 和染色体 DNA 。两种 DNA 在强碱环境都会变性。

当加入 pH4.8 的酸性乙酸钾降低溶液 pH 值后，质粒 DNA 将迅速复性，而染色体 DNA 分子巨大，难以复性。

通过离心，大部分细胞碎片、染色体 DNA 、RNA 及蛋白质沉淀（ SDS 的作用下 ）除去，而质粒 DNA 留在上清中 。

再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒 DNA 。 ②RNA提取

Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

TRIzol的主要成分是酚。主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 0.1%的8－羟基喹啉的，与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制

异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。 β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。 ③核酸凝胶电泳

1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；当电场加载于具导电性的缓冲液中的琼脂糖凝胶上后，DNA片段在凝胶中依据其大小和形状以一定的速率向正极方向移动。较小的线性片段比较大片段移动得快，因为较大片段会被构成凝胶的琼脂糖纤维网的障碍所阻滞；

2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小（构型）、介质粘度等的函数；

因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下、可在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。

2. 将基因组进行PCR扩增

RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

3. 将DNA电泳片断切胶回收

重组质粒与原载体可经琼脂糖凝胶电泳，因大小不同而相区分，也可用插入时所用的限制酶再将目的片段切割出来。

首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA的原理（在高盐、低pH值情况下吸附DNA；低盐、高pH值情况下释放DNA。离心柱上含有Resin合成树脂，具有吸附DNA的功能），配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，在几分钟之内即可以高效回收核酸片段。

4. 扩增,回收后进行连接载体 DNA 连接

T4DNA连接酶可以修复双链DNA骨架的断裂，催化限制酶酶解反应的逆反应，使退火的互补黏性末端共价连接在一起，形成新的DNA分子。

主要是催化双链DNA一端的3’-OH与另一双链DNA 5’端的磷酸根形成3’,5’-磷酸二酯键，使具有相同粘末端或平端的DNA末端连接起来。

此外，在构建 DNA 重组分子中使用的工具酶还有：DNA 聚合酶、逆转录酶、DNA 修饰酶、RNA 修饰酶、核酸外切酶、碱性磷酸酶等。

5.连接的片断转化到感受态细菌中

用含Ca2+的溶液处理的大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA，这一过程被称为转化。

质粒通过转入具有特定遗传性状的大肠杆菌菌株而被克隆。用Ca2+处理大肠杆菌细胞，可使之成为易接受质粒DNA的感受态细胞。将这样的细胞涂布于琼脂平板，会长出单克隆或多个克隆。

6.转化后酶切鉴定

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA，可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。

四.实验步骤

1.基因组的获取 ①质粒DNA的提取：

溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris?Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0）。 溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，1% SDS，现用现配。

溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60 mL，冰醋酸11.5 mL，水28.5 mL，pH 4.8。

取1.3ml菌液→5000r/min离心2min，去上清→加入溶液1 100ul，吹打→加入溶液2 200ul，轻颠4~5次，冰浴2min→加入溶液3 150ul，轻颠4~5次，冰浴5min→10000r/min离心5min，取上清→加入酚和氯仿各200ul，共400ul，轻颠4~5次→加2倍体积乙醇(700ul),冰浴30min，离心5min→去乙醇，风干，加20ul去离子水

②RNA的提取:狗肝捣碎+Trizol试剂→取200ul上清液，静置5分钟后→加入氯仿200ul→振荡15s→静置2min→10000r/min离心5min，取上清液→加入500ul异丙醇，室温静置10min→10000r/min离心5min，弃上清液→加入75%乙醇1ml，冰浴5min→10000r/min离心5min，弃上清液→晾干→加200ul去离子水溶解 ③核酸凝胶电泳 1）制胶

Ⅰ.准备好凝胶成型器，插入成型梳。

Ⅱ.将1.5g琼脂糖加至100 ml 1×TAE缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全熔化，冷却至60℃以下。

Ⅲ.加入5ul溴化乙锭（终浓度0.5ug/ ml ）至熔化的琼脂糖液中混匀，但避免出现气泡。 Ⅳ.将冷却的琼脂糖倒入凝胶成型器，制备凝胶。 2）电泳

Ⅰ.待胶变硬，直到它呈乳白状且不透明（约20分钟），小心垂直向上拔出梳子，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。

Ⅱ.用移液器吸取2μl 的6X载样缓冲液于封口膜上，再加入5μl样品，混匀后，小心加入点样孔。

Ⅲ.接通电源，调节电压至4-5V/cm，DNA从负极移到正极。电泳时间30－60分钟。 Ⅳ. 电泳结束，关掉电源。

2. 将基因组进行PCR扩增(RT-PCR)

弓形虫RNA+反转录酶+dNTP+Oligo dt→cDNA 3ul→加入上下引物各1ul→加入DNA聚合酶 0.3ul→加入dNTP 2.5ul→加入buffer MgCl2 2ul→加入去离子水 11~12ul→放入PCR仪→94°C 3min→94°C 1min，55°C 30s，72°C 2min，进行30个循环→ 72°C 8min

3. 将DNA电泳片断切胶回收

根据质粒体积加入2倍溶胶溶液(DB) → 65°C水浴锅10min溶化→取650ul→加入过滤柱→10000r/min离心30s→加入700ul漂洗液(WB) →10000r/min离心30s→加入500ulWB→10000r/min离心30s→弃上清液→11000r/min离心30s→将过滤柱移到1.5ml尖头离心管，并去除过滤柱盖子→加入去离子水20ul→10000r/min离心30s→液体抽出放膜上→放置5min→10000r/min离心1分钟→除去过滤柱，跑电泳

4. 扩增,回收后进行连接载体

①粘性末端的连接：用同一种限制性内切酶或者用能够产生相同粘性末端的两种限制性内切酶分别消化外源DNA分子和载体，所形成的DNA末端彼此互补，用DNA连接酶共价连接起来，形成重组体DNA分子。

②平末端的连接：可先生成粘性末端，在带平头末端的DNA片段的3’-末端加上多聚核

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