生物化学实验三 紫外吸收法测蛋白质浓度

实验三 紫外吸收法测蛋白质浓度

13生物基地 201300140059 刘洋 2015-04-03

同组者：张奕

一、 实验目的

1. 了解紫外吸收法测蛋白质浓度的原理 2. 熟悉紫外分光光度计的使用

二、 实验原理

蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量。

由于核酸在280nm波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有一定的干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处。如同时测定260nm的光吸收，通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。因此如溶液中存在核算时必须同时测定280nm及260nm的吸光值，方可通过计算测得溶液中的蛋白质浓度。

三、 实验器材

紫外可见光分光光度计 试管*9 5ml 移液管 吸管 漩涡混合器 烧杯

四、 实验试剂

标准酪蛋白 1mg/ml

样品血清（稀释100倍） 蒸馏水

五、 实验步骤

用紫外分光光度计测定蛋白质浓度的办法有直接测定法和标准曲线法，本次实验采用标准曲线法。

1.标准曲线的绘制

取6支试管，按下表加入试剂。

试剂 水 标准酪蛋白 血清 1 5.0 0.0 0.0 2 4.0 1.0 0.0 3 3.0 2.0 0.0 4 2.0 3.0 0.0 5 1.0 4.0 0.0 6 0.0 5.0 0.0 加毕，混匀，用紫外分光光度计测A280nm，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图

2.样液测定

取样液2.5ml，加蒸馏水2.5ml，测A280nm，平行三份，对照标准曲线求得蛋白质浓度。

六、 实验结果

试剂 水 标准酪蛋白 酪蛋白浓度 A280nm 1 5.0 0.0 0.0 0.000 2 4.0 1.0 0.2 0.161 3 3.0 2.0 0.4 0.369 4 2.0 3.0 0.6 0.576 5 1.0 4.0 0.8 0.710 6 0.0 5.0 1.0 0.866

A260nm

标准酪蛋白溶液浓度(g/l)

由A=kcl和回归直线斜率得，k=0.8906 mg/cm 样品测定：2.5ml血清+2.5ml蒸馏水 样品编号 1 2 3 4

A280nm —

0.720 0.729 0.752 其中第三组数据弃掉 得：280nm=0.725

由标准曲线得C 1= A280nm/0.8906*2*100=162 mg/ml

使用直接计算法的公式得C2= A280nm/6.3*10*2*100=230 mg/ml

A

七、 讨论与结论

本次实验结果尚可，分析如下：

第三组样品的吸光值与前两组偏离较高，猜想可能是配制溶液时由于操作问题，蒸馏水加入量较少导致。使用直接计算法得到的结果和标准曲线法得到的结果相差很大，这是由于样品并非纯蛋白所致。

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