酪氨酸酶的粗提取,分离纯化、纯度鉴定及活性测定(2)

5.浓缩胶凝固后，在电泳槽上下两端注满1×电泳缓冲液（上槽加5×电泳缓冲液可加快电泳速度，节省电泳时间），然后小心缓慢取下梳子，用枪头小心拨去胶板上缘多余的胶，小心调整弯曲的胶孔。

6.处理样品：用移液枪吸取各个酪氨酸酶样10μl于小ep管内，加入10μl 2×样品溶解缓冲液，混匀后沸水浴5min，低分子蛋白marker不沸水浴，不加2×样品溶解缓冲液，用10μl移液枪小心将各个样品加入上样孔内。

7. 连接导线，80V电压电泳，待样品进入分离胶后，上调电压使电流不超过40mA为宜，当指示剂到达距胶下缘时，停止电泳。

8.用撬胶板小心撬开玻璃板，沿分离胶与浓缩胶界面，以及两侧与玻璃板的边界切下，在胶面面对上样的方向的右下角切下小角，保证识别方向。考马斯亮蓝染液加入大培养皿。置于小型摇床上，调整转速，染色过夜。回收染色液，将染色后的胶片置于加入脱色液的大培养皿内，置于摇床上，洗掉多余的染液，没3h换一次脱色液，待胶片上多余的染液洗脱干净后，将胶片取出，观察电泳条带。 （四）酪氨酸酶活性的鉴定

1.在石英比色皿内加入pH6.0磷酸缓冲液1.4ml及0.2mol/L 邻苯二酚溶液1.0ml，混匀。

2.将石英比色皿放入Ultrospec 2100 pro紫外可见分光光度计内，迅速加入0.1ml所得酪氨酸酶液，在411nm处，每隔一分钟测定一次，绘出吸光度对时间的变化曲线。从曲线斜率求酶的活性。

实验结果及分析：

（一）粗酶液活性的定性测定结果

在一定物质的量浓度的邻苯二酚溶液内加入少许粗酶液，振荡片刻，同空白对照对比，呈现深黄色，颜色变化明显，说明粗酶液有活性，可以

图1. 粗酶液有活性

使用离子交换色谱法分离纯化。

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（二）酪氨酸酶的分离纯化结果

1.离子交换色谱分离过程中，蛋白质紫外吸收吸收曲线如图2所示，可以看出，杂蛋白吸收峰很低，说明杂蛋白含量很低。而酪氨酸酶吸收峰也不是十分可观，说明所得酪氨酸酶浓度偏低。

图2.离子交换色谱蛋白质紫外吸收吸收曲线（图中蓝线）

2. 按照吸收峰，初步判断13-25号管内含有酪氨酸酶，将其分装并冷冻保存。混合pH6.0磷酸缓冲液1.4ml及0.1mol/L 邻苯二酚溶液1.0ml，再加入0.1ml各管收集到的酶液，记录开始变色时间，将各管反应半个小时以上，测最终吸光度值并记录如表一。按照开始变色时间及最终吸光度的值，可以判断13、14、21-25号管基本无酶活性。17号管内的酶活性最强，18、19号管次之。 管号

开始变色时间/min

15 5 0.226

16 5 0.278

17 3 0.423

18 3 0.323

19 4 0.328

20 4.5 0.180

吸光光度值(411nm)

表一. 以邻苯二酚为底物反应筛选有酶活性的试管

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图3. 15-20号管的酶活性测定反应体系

（三）酪氨酸酶纯度鉴定结果

通过多次SDS-PAGE电泳，没有得到蛋白质电泳条带（隐隐约约，依稀可见）。分析原因可能为所的样品中酪氨酸酶虽然活性较高，但浓度较低所致。三次蛋白电泳条带结果如图4。由于每次SDS-PAGE同其他一起进行并共用胶片，操作条件一致，所以排除操作因素引起的误差。

图4. 三次蛋白电泳条带图（图中空白皆为我组结果） （四）酪氨酸酶活性的鉴定结果

根据实验所得吸光度随时间的变化曲线可知，17号管，即经过纯化的酶液的活性较高，且高于粗酶液。其中，17号管吸光度随时间变化曲线斜率为0.033，粗酶液为0.02。

时间/min

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

7.5

8.5

9.5

10.5

17号管OD411 0.283 0.391 0.475 0.539 0.585 0.617 0.637 0.649 0.654 0.653 0.648

粗酶液OD411 0.230 0.499 0.630 0.693 0.715 0.713 0.696 0.670 0.641 0.609 0.580

表二.酪氨酸酶活性鉴定数据记录

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图6. 17号管酪氨酸酶和邻苯二酚反应体系吸光度随时间变化曲线

图5.粗酶液和邻苯二酚反应体系吸光度值随时间的变化曲线

（五）实验思考和改进

1.盐析的过程仅仅以文献查得数据进行，设计过于简单，致使实验粗糙，提取得到的酪氨酸酶酶浓度过低，应该在实验中设对照实验，选取最佳盐浓度，并采用分级沉淀，达到更好的盐析效果。

2.由于盐析的操作给粗酶液中带入了大量的离子，如果透析的步骤没有做好，则使用离子交换色谱柱时，酪氨酸酶不能很好地吸附于柱内介质上，所以，可以先不用盐析，直接进行离子交换色谱法的分离。

3.实验中虽然多次进行蛋白质电泳，也由于缺乏标准牛血清蛋白的缘故，没有测定酪氨酸酶的浓度，而酪氨酸酶的浓度恰恰是SDS—PAGE的关键，所以在实验中应该先进行酪氨酸酶浓度测定，保证每个上样孔内加入的酪氨酸酶的浓度一致，浓度过低时，采用适当手段（如冷冻干燥）浓缩后再进行SDS-PAGE，效果会更好。

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4.测定酪氨酸酶活性的实验中，由于时间较短，所以只采用一个底物浓度（邻苯二酚终浓度0.08mol/L），如果采用多组底物浓度，再采用双倒数法，可以测出酪氨酸酶反应的Km值。

实验结论

本次综合开放实验，通过小组成员之间认真合作，初步获得了酪氨酸酶的粗酶液以及经离子交换色谱纯化后的酪氨酸酶溶液，酶的活性较高，浓度较低。

实验心得

本次实验结果虽然不是十分理想（酶的浓度过低，SDS-PAGE电泳未能观察到条带），但对于我们团队与小组成员个人都是一次很好的锻炼。从一开始查阅文献设计实验思路，到实验中的每一步具体的操作，以及遇到问题时分析问题，解决问题的能力，每一步都是实验成败的关键。

通过此次实验，我们增强了团队合作能力，掌握了一些常用的分离纯化方法

（如SDS-PAGE电泳，离子交换色谱法）。面对盐析后沉淀过少的结果，我们也想过放弃。为了将SDS-PAGE电泳做成功，我们总共做了三次，甚至坚持通宵做实验，我们也执着过，无论最后的结果怎样，这次实验都是对我们的一次考验和提升。

致谢

感谢给我们认真修改实验方案的孔老师，每日亲临实验室指导的张老师，耐心教我们使用离子交换色谱的金韩学长以及一起合作，相互学习的其他小组成员。

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