激光拉曼光谱在蛋白质构象研究中的应用和进展(2)

2.3　单晶中的蛋白质构象改变

2　单晶中的蛋白质结构

拉曼能实时监控蛋白质单晶里的化学事件,包括决定酶2抑制剂或酶2底物络合物相互作用的化学性,定量检测晶体中的配位体数量,实时追踪活性位置的

[6]

化学反应。拉曼晶体学(Ramancrystallography)优于传统拉曼差谱方法(溶液中)的原因就在于晶体的高浓度使信噪比显著提高,并可得到低而稳定的基线背景

[7]

当配位基吸入晶体并结合到活性位点,拉曼结晶学能够跟踪晶体内的结构变化

2

[12]

。拉曼晶体学

可用于研究反式羧基酶的5S亚单位(一个用羧基生物素的CO2把络合的丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的二聚物)

[13]

。

2.1　晶体里的反应媒介:β内酰胺酶(β2lactamases)

。通过观察发现,5S的二级结构拉曼标

和抗药性

拉曼晶体学能确认并跟踪单晶中反应中间物。例如,青霉素(penicillin)和它的衍生物可以通过干

记在晶体与晶体间差别很大,pH7时的晶体显示为α2螺旋和β2片层二级结构拉曼标记的混合体,但是当周围母液中pH降低至5时α2螺旋标记强度显著

激光拉曼光谱在蛋白质构象研究中的应用和进展

　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第518

16卷

β2　　图1　内酰胺酶抑制剂结构

　　Fig.1　

Structureofβ2lactamasenace,NMR)X2射线结晶学(受弱衍射和大单元细胞

晶体的无序限制)难以研究这些蛋白装配。拉曼光谱学由于其特有的高分辨技术可用于此类研究。通常拉曼差谱应用与尺寸大小和散射性质无关,同时拉曼差谱技术在检测大分子络合物的微小结构变化时特别灵敏。这些优点使应用拉曼光谱分辨蛋白

图2　E166A内酰胺酶晶体内两种可能的烯胺类酰基酶[7]

Fig.2　Twopossibleacyl2enzymeenaminespeciesintheE166Alactamasecrystal

[7]

质、脂肪和核苷酸成为可能3.1　噬菌体<6

[15216]

。

噬菌体<6是一种含脂肪的双链RNA病毒。病毒分几步装配,第一个可检测到的中间物是原壳

(procapsid),它是一个含有四个病毒的蛋白质十二

下降,而β2片层标记则上升

。胰岛素为50%α2螺旋,但当晶体中的S2S联接降为SH,所有α2螺旋标

[14]

记从晶体的拉曼谱图上消失并被β2片层取代。与之相反,12S亚单位对pH变化不敏感。当底物甲基丙二酸单酰辅酶A(methylmalonyl2coenzymeA,

MM2CoA)吸附时,只经历微小构象改变,而将MM2CoA和生物素都加到母液中时12S晶体蛋白质则从

[7,14]α2螺旋和β2片层混合体转变为完全β2片层。

[14]

聚体装配:P1(主要结构蛋白,120个拷贝),P2(RNA

依赖性RNA聚合酶,12个拷贝),P4(包装驱动器,

12个六聚体)和P7(装配和包装因子,30个二聚

体)。原壳是一种能有选择地包裹,复制和转录病毒

RNA的复杂的分子机器

[17218]

。应用拉曼差谱方法分

[19]

析异型原壳装配能更好地了解不同蛋白质间相互作用,并反映组装过程中的构象变化特色。由于每

个异型原壳缺失一个蛋白(分别为P2、P4和P7)导致原始原壳和异型原壳之间存在拉曼差谱,在组装状态下产生了蛋白质光谱信号。把这些信号与单独的蛋白质作比较,发现了多种差谱峰。在1302

cm、1330cm和1652cm的正向峰表示装配状态

21

21

21

虽然以上三种蛋白质12S、5S和胰岛素构象转

变的机理目前还不清楚,但在β2片层转变形式中均拥有相同的性质:(1)转变为β2片层为主的改变是不可逆的;(2)晶体形态不变,但再也不能衍射X2射

[7]

线;(3)晶体溶解度极大地减少。这些变化说明,晶体里的蛋白质能够经历相对大规模构象变为β2片

下α2螺旋成分增多,1243cm和1684cm的凹槽峰说明组装的无序结构减少。另外,许多支链标记峰

2121

的强度发生了改变(酪氨酸在831cm～857cm的双峰)。这些谱图变化支持了在P4功能域C端的α2螺旋结构折叠伴随装配的模式。由于P4蛋白对原壳装配成核性具有重要意义化对装配初始化是必需的。3.2　噬菌体HK97的成熟

[17]

2121

层二级结构形式。由于此类蛋白质在构象转变中迅速丧失衍射功能,因此不宜用X2射线分析,而拉曼结晶法则弥补了这一不足。

3　蛋白质装配(assemblies)

病毒颗粒主要由核酸和蛋白质组成,蛋白质衣壳可保护病毒核酸免受外界因素影响破坏,并可介导病毒核酸进入细胞内部,病毒衣壳是由病毒结构

蛋白装配形成的。核磁共振(nuclearmagneticreso2

,因此,这个构象变

噬菌体HK97是一个双链DNA病毒,在病毒衣壳装配过程中有四种衣壳演变形成:

(1)前头部Ⅰ(ProheadI):由415个结构蛋白亚

激光拉曼光谱在蛋白质构象研究中的应用和进展

第4期　　　　　　　　　　　　王　敏等:激光拉曼光谱在蛋白质构象研究中的应用和进展　　　　　　　　　　　519

基构成,衣壳蛋白之间无酶解、共价交联和构象变化,易被离解为多个壳粒。ProheadI蛋白自体分解释放出N端Δ2功能域(residues22103)并进到Pro2

headII阶段。

(2)前头部Ⅱ(ProheadII):衣壳大小不变,由于

拉曼差光谱技术在医疗诊断中的应用前景也很可观。应用拉曼差光谱分析疾病模型羊神经系统退行性病变与血清拉曼光谱变化之间存在相关性,有望建立快速诊断疾病的方法

[29]

。Carey等

[30]

应用拉

衣壳蛋白氨基端被水解,所以衣壳内层密度变弱。

(3)前头部Ⅰ(HeadI):病毒核包装,衣壳膨胀,厚度变小,壳粒结构发生明显变化,各结构蛋白亚基之间发生交联。

(4)前头部Ⅱ(HeadII:,56基形成的寡聚体,各亚基之间重排形成牢固的20面体立体对称结构。用数字式拉曼差谱分析ProheadI的Δ2功能域显示其高度

[20]α2螺旋化,有利于正确装配,ProheadII到HeadII

曼显微镜分析阿兹海默症患者脑内老年斑(淀粉样

蛋白质),发现了拉曼,从而构建一拉曼光谱分析可以提供丰富的关于蛋白质结构的信息,使得研究人员在X2射线晶体衍射分析、核磁共振技术之外有了新的手段对蛋白质结构进行研究。相信随着激光技术、检测技术的发展以及新的拉曼光谱技术和方法的提出,激光拉曼光谱技术必将得到更广泛的应用,促进蛋白质等生物大分子的研究进展。

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