年产3吨中性淀粉酶发酵工艺设计(3)

2.3.1 灭菌方法

所谓灭菌，就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。常用的灭菌方法有：化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤灭菌等。本实验采用湿热灭菌。

2.3.2 培养基的湿热灭菌

条件为在121℃（表压约0.1MPa）维持30分钟。

湿热灭菌即利用饱和水蒸气进行灭菌，是工业中最重要的灭菌方法。在同样的温度下，温热的杀菌效果比干热好，其原因有：①蛋白质凝固所需的温度与其含水量有关，含水量愈大，发生凝固所需的温度愈低。湿热灭菌中菌体蛋白质吸收水分，较同一温度的干热空气中易于凝固而杀灭各种微生物。②温热灭菌过程中蒸气放出大量潜热，加速提高温度。因而湿热灭菌比干热所要温度低。如在同一温度下，则湿热灭菌所需时间比干热短。③湿热的穿透力比干热大，使深部也能达到灭菌温度，故湿热比干热收效好。

一．影响灭菌效果的因素

⑴微生物的种类和数量；

⑵培养基性质、浓度、成分；

⑶灭菌的温度、时间。

二．热阻：微生物对热的阻抗能力。

三．灭菌原理

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对数残留定律：经加工灭菌，死亡微生物速度和存在的微生物数量成正比。

2.4 空气灭菌

此课题为好氧发酵，以空气作为氧源。根据国家药品质量管理规范的要求，生物制品、药品的生产场地业需要符合空气洁净度的要求。获得无菌空气的方法有：辐射灭菌、化学灭菌、加热灭菌、静电除菌、过滤介质除菌等。

过滤介质除菌是目前发酵工业中空气除菌的主要手段，其介质有棉花过滤器、超细玻璃纤维纸、石棉滤板、金属烧结管等。

2.4.1 过滤除菌流程及设备

流程如下：采风塔→空气粗过滤器→空气压缩机→储气罐→冷却器→旋风分离器→冷却器→丝网除沫器→空气加热器→总空气过滤器。

设备如下：

1.采风塔：采风塔建在工厂的上风头，高至少10 m,气流速度8 m/s。

2.粗过滤器：主要作用是拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机，同时起一定的除菌作用，减轻总过滤器的负担。

3.空气压缩机：作用是提供动力，以克服随后各设备的阻力。

4.空气储罐：作用是消除压缩空气的脉动。

要求：H/B=2～2.5 V=（0.1～0.2）V1

其中，H为罐高；

B为罐直径；

V1为空压机每分钟排气量（20℃，1×10Pa状况下）。

5.旋风分离器：是利用离心力进行气-固或气-液沉降分离的设备。作用是分离空气中被冷却成雾状的较大的水雾和油雾粒子。

6.冷却器：空压机出口温度气温在120℃左右，必须冷却。另外在潮湿的地域和季节还可以达到降湿的目的。

7.丝网除沫器：可以除去空气中绝大多数的20µm 以上的液滴和1µm以上的雾滴，一般采用规格为直径0.25㎜×40孔且高度为150㎜的不锈钢丝网。

8.空气加热器：列管内走空气，管外走蒸汽。可将空气湿度由100%降低到70%以下。 5

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9.总过滤器：填充物按下面顺序安装：孔板→铁丝网→麻布→活性炭→麻布→棉花→麻布→铁丝网→孔板。介质要紧密均匀，压紧一致，上下棉花层厚度为总过滤层厚度的1/4，中间活性炭层为1/3。

2.4.2 无菌空气的检查

现在采用的无菌检查实验方法有肉汤培养法、斜面培养法和双碟培养法。这里采用斜面培养法来检查。具体方法如下：

500ml三角瓶内装斜面培养基50m1，其组成为麦芽糖6％、豆粕水解液6％、Na2HPO4·12H2O 0.8％、(NH4)2SO40. 4％、CaCl2 0.2％、NH4C1 0.15％，

pH 6.5～7.0，接种后置旋转式摇床亡，(37±1)℃下培养28h左右备用。

2.5 发酵罐的灭菌

发酵罐的灭菌可采用空罐灭菌和实罐灭菌，此处采用空罐灭菌。空罐灭菌是将所有的通气口都稍微打开，然后通入热水蒸汽，让水蒸汽尽量通过每一个菌落达到灭菌效果。具体方法是：在121℃灭菌30分钟。

3. 种子扩大培养

本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。设计流程如下：

孢子→锥形瓶→种子罐→种子罐→发酵罐

3.1 孢子制备

将保存在淀粉琼脂斜面上的枯草芽孢杆菌孢子用无菌水洗下，接种到锥形瓶中，在35℃静置培养2～4天，待长出大量孢子后作为接种用的种子。

3.2 种子制备

将保藏的菌种接种到马铃薯茄子瓶斜面（20%马铃薯煎出汁加MgSO4·7H2O 5 mg/L，琼脂2%，pH 6.7～7.0），37℃培养3天。然后接入到20L种子罐，37℃搅拌，通风培养12～14小时。此时菌种进入对数生长期（镜检细胞密集，粗壮整齐，大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液pH 6.3～6.8,酶活5～10U/mL），再接种到发酵罐。

3.3 发酵罐培养

培养基的配制：用麦芽糖液配置成含麦芽糖6％、豆粕水解液6％～7％、

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Na2HPO4·12H2O 0.8％、(NH4)2SO4 0.4％、CaCl2 0.2％、NH4Cl0.15％、豆油1kg、深井水20L，调pH至 6.5～7.0。

发酵罐培养基经消毒灭菌冷却后接入3%～5%种子培养成熟液。培养条件为：温度37±1℃，罐压0.5kg／cm2，风量1～20h 为1：0.48vvm，20 h后1：0.67vvm，培养时间为28～36 h。

4. 发酵罐的设计

4.1发酵罐的结构

通用发酵罐的主要组成部件有：

1.罐体：是发酵罐的主要结构，其内壁有挡板，作用是防止液内中心产生漩涡，一般用3～5块挡板。

2.搅拌装置：主要功能是使罐内物料混合均匀，搅拌器叶轮多采用搅拌涡轮式，搅拌轴要与罐体密封严实，防止漏液和染菌。搅拌转速为200r/min.

3.传热装置：有夹套，列管等，这里采用外夹套。

4.通气部分：通过空气分布器将通入的无菌空气均匀分布到发酵液中，发酵罐通风量0～12 h为1：0.67vvm ,12 h至发酵结束通风量为1：（1.0～1.33）vvm 。分布器有单管式和环形管式。

5.消泡装置：用于消除产生的泡沫，最简单实用的消泡装置是耙式消泡器，直接装在搅拌轴上。

6.进出料口：罐顶设有进料口，罐底有出料口。其他附属设备还包括试镜、人孔（手孔）、取样管等，用以观测和检修。

4.2发酵罐的工艺尺寸

常用的机械通风发酵罐的结构和主要几何尺寸标准化设计（见附图）

其几何尺寸比例如下：

H0/D=1.7～3.5 H/D=2～5 d/D=1/3～1/2 W/D=1/12～1/8 B/D=0.8～1.0 (S/d)2=1～2 (2表示搅拌器挡数) h/D=1/4 单位全部为m

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