年产3吨中性淀粉酶发酵工艺设计(2)

包括：琼脂块透明圈法初筛。

方法：倒入选择培养基6皿，取其中较厚的2皿，用打孔器或玻璃打制圆形培养基→平移琼脂块至一个选择平板上，再用接种针挑取单菌落的少量菌体分别接种于琼脂块中心并与一琼脂块接入出发菌株作为对照→正置于37℃培养45小时→于培养好的选择平板中滴加几滴淀粉天青，观察到透明圈的直径→选择透明圈大的菌落接入斜面备复筛用。

摇瓶发酵复筛：将经初筛处的菌株分别接入增殖培养基中，培养13小时→分别接种于锥形瓶发酵培养基中→置37℃摇床上发酵40小时→选出酶活力较高者进一步复筛直至选出中性淀粉酶高产突变株。

1.3 菌种的保藏

菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产，如氨基酸、抗生素、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。

菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。常用的菌种宝藏方法有：斜面冰箱宝藏法、沙土管宝藏法、菌丝速冻法、石蜡油封存法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法。

在这里我们采用沙土保藏法。方法：将需保藏的菌种经斜面培养后用无菌水制成孢子悬液，加入经灭菌处理的沙和土的混合物（或纯沙亦可）作为载体，减压抽去水分，这些吸附有孢子的干燥沙土载体，在低温下保存。

操作步骤：斜面孢子先加灭菌蒸馏水2～2.5ml，沿斜面轻刮孢子后，再吸0.2～0.3 ml到灭菌备用的沙土管中，在真空度100 Pa以下进行干燥，直至沙土

年产3吨中性淀粉酶发酵工艺设计

管外貌呈松散状态，然后低温（4℃）保存。经真空干燥后的沙土管，最好放在密闭容器内，容器内可放入吸潮剂CaCl2 或硅胶等，保藏期间整个容器置于冰箱内。一般保存期为一年左右。

2. 培养基的配制

2.1 培养基的类型

培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。微生物大规模发酵设计主要用到孢子,种子和发酵培养基这三种类型。

2.1.1 孢子培养基

孢子培养基配制的目的是供菌体繁殖孢子的，常采用的是固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长快速，产生数量多而优质的孢子，并且不会引起菌体变异。对孢子培养基的要求：①营养不要太丰富；②所用无机盐的浓度要适量；③注意培养基的pH和湿度。

中性淀粉酶的孢子培养基配置如下：将麸皮5％、豆饼粉3％、蛋白胨0.25%、琼脂2%（pH 7.1）制成斜面培养基，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min 。

2.1.2 种子培养基

种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮成为活力强的种子。对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。

中性淀粉酶的种子培养基的配置：将豆饼1%、蛋白胨和酵母膏各0.4%、氯化钠0.05%配置成种子培养基(pH 7.1～7.2)，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min。

2.1.3 发酵培养基

发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能力，但要注意成本和能耗。

中性淀粉酶的发酵培养基配方是：麸皮70％、小米糠20％、木薯粉10%、烧碱0.5%，加水使水量达60％，常压蒸汽灭菌1h。

年产3吨中性淀粉酶发酵工艺设计

2.2 培养基的营养要求

培养基的成分大致分为碳源、氮源、无机盐、微量元素、特殊生长因子、促进剂、前体和水等几大类。对不同的微生物，微生物不同的生长阶段，不同的发酵产物以及不同发酵工艺条件等，所使用的培养基都是不同的，这些也都是培养基配制需要考虑的因素。

2.2.1 水

水是所有培养基的主要成分，也是微生物机体的重要组成成分。水是良好的溶剂，又是活细胞中一切代谢反应的媒介物，还可以维持细胞中的渗透压，同时水又是热的良好导体，有利于散热，可调节细胞温度。在中性淀粉酶的发酵生产中，为了避免水质变化给生产带来不良影响，发酵用水采用深井水，并定期检查水质，要求：pH 6.8～7.2，电导率500～1500μΩ/cm，总硬度 100～230 mmol/L。

2.2.2 碳源

碳源的主要为微生物细胞的生长繁殖提供能源。目前生产中性淀粉酶的菌种为异养型微生物，所以只能利用有机碳；大量的农副产品是主要的有机碳源，如山芋、麸皮、玉米、米糠、马铃薯、木薯、土茯苓等淀粉质原料，这里用到的碳源是麸皮、马铃薯、木薯。

2.2.3 氮源

氮源是组成蛋白质和核酸的主要元素，酶自身即为蛋白质。因此，氮源是必不可少的重要原料。常用的有机氮源油花生饼粉、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉等。我们用到的氮源是豆饼粉剂和蛋白胨。

常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。

2.2.4 无机盐类及微量元素

酶在生长和繁殖生长过程中，需要某些无机盐及微量元素如磷、镁、硫、钾、钠、钙、铁、锰、锌等。钠离子具有控制细胞和培养基之间的渗透压的作用，从而促进产酶，添加适量亚硝酸钠可提高酶活力；钙对淀粉酶有稳定和活化作用。中性淀粉酶生产中通常以氯化钙提供钙离子。

2.2.5 生长因子和产酶促进剂

酶的生产中所需的生长因子大多由天然原料提供。玉米浆、麦芽汁、豆芽汁等，都含有丰富的生长因子。产酶促进剂一般是该酶的底物和底物类似物，对于

年产3吨中性淀粉酶发酵工艺设计

中性淀粉酶，可添加适量浓度的淀粉琼脂糖作为诱导剂。

2.3 培养基的灭菌

生物化学反应过程中，特别是细胞培养过程，往往要求在没有杂菌污染的情况下进行，这是由于生物反应系统中通常含有比较丰富的营养物质，因而很容易受到杂菌污染，进而产生各种不良后果：（1）由于杂菌的污染，使生物化学反应的基质或产物消耗，造成产率下降；（2）由于杂菌所产生的某些代谢产物，或染菌后发酵液的某些理化性质的改变，使产物的提取变得困难，造成收得率降低或使产品质量下降；（3）污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败；（4）污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH，从而使生物化学反应发生异常变化；（5）发生噬菌体污染，微生物细胞被破裂而使生产失败等。

百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说高考高中年产3吨中性淀粉酶发酵工艺设计(2)在线全文阅读。