柱层析实验报告(3)

五、凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存 一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02％的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。 如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保

存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。 六、 凝胶层析的应用 1. 脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为sephadexg-10、15、25或bio-gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗

脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。 2.用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生 物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。 3.测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在

测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。 4. 高分子溶液的浓缩：通常将sephadexg-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之

外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。 第二章 实验内容 一、实验目的

通过从粗油中分离甘油三酯，学习运用凝胶色谱法分离油脂中各个成分的方 法。 二、实验原理 吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱， 以使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。硅 胶色谱频繁使用在脂质中的单一脂质，糖脂质以及磷脂质的分离。各种脂质被硅 胶吸附，随着洗脱溶液的极性增加，

各种极性不同的化合物被分离出来。 三、实验材料与试剂 正己烷200ml、、乙醚15ml、蒸馏水1.3ml、硅胶（100目左右）25g 四、实验仪器 层析柱(1.5×75cm) 、250ml 三角容量瓶、分析天平（0.001g）、真空浓缩装 置、搜集瓶

五、实验提取工艺流程 1. 活化硅胶（110度，6小时干燥）25g中加入5%蒸馏水使其部分钝化并充分混匀放置

30分钟。加入正己烷至刚好淹没硅胶为止并用超声波脱气3分钟。 2. 层析柱底部放入脱脂棉少许（防止硅胶泄漏），将硅胶放入到层析柱中正己烷溶液要没过硅胶层表面。 3. 准确称取食用油1±0.001 g 加入到硅胶层析柱中用150ml 正己烷/乙醚（87∶13，

v/v）洗脱，洗脱速度为2-3滴/min。洗脱时表面不能干和。 4. 收集的洗脱液用真空浓缩装置浓缩至无有机溶剂气味为止。

5. 准确称取浓缩物质量篇五：实验一 柱色谱 实验一 柱色谱、薄色谱 一、实验目的

1、了解色谱法分离提纯有机化合物的基本原理和应用。 2、掌握柱层析、薄层层析的操作技术。 二、实验原理

色谱法（chromatography）亦称色层法、层析法等。 色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性的差异，使混合物的

溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。 色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几方面: 1、分离混合物 一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物，一般应用化学

方法分离很困难，但应用色谱法分离，有时可得到满意的结果。 2、精制提纯化合物 有机化合物中含有少量结构类似的杂质，不易除去，可利用色谱法

分离以除去杂质，得到纯品。 3、鉴定化合物 在条件完全一致的情况，纯碎的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移 动距离，称比移值（rf值），所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。所以，要获得重现的

比移值就比较困难。为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。 4、观察一些化学反应是否完成，可以利用薄层色谱或纸色谱观察原料色点的逐步消失，以证明反应完成与否。 吸附色谱主要是以氧化铝、硅胶等为吸附剂，将一些物质自溶液中吸附到它的表面上，而后用溶剂洗脱或展开，利用不同化合物受到吸附剂的不同吸附作用，和它们在溶剂中不同

的溶解度，也就是利用不同化合物在吸附剂上和溶液之 间分布情况的不同而得到分离。吸附色谱分离可采用柱色谱和薄层色谱两种方式。 柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两种。吸附色谱常用氧化铝和硅胶为吸附剂。分配色谱以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收较大量的液体作为固定相。吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带，再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集；

或将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来 薄层色谱又叫薄板层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。此外，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。 二、基本操作训练：（含仪器装置和主要流程图） 正确装柱、制板、点样及分离操作 （1） （2） （3） 柱层析 薄层板在不同的层析缸中展开的方式 【操作步骤】

薄层色谱

1、薄层板的制备（湿板的制备） 薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。薄层应尽量均匀且厚度要固定。否则，在展开时前沿不齐，色谱结果也不易重复。在烧杯中放入2g硅胶，加入5—6ml蒸馏水，调成糊状。将配制好的浆料倾注到清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的左右摇晃，使其表面均匀平滑，在室温下晾干后进行活化。也可买市售的硅胶板切割成适宜大小备用。本实验用此法制备薄

层板5片：吸附剂为硅胶g，用0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液调成浆料。 2、点样

先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过2mm。若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效

果。若在同一板上点几个样，样点间距离应为 1。点样要轻，不可刺破薄层。 3、展开

薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行。为使溶剂蒸气迅速达到平衡，可在展开槽内衬一滤纸。在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其高度不超过1cm。将点好的薄层板小心放入层析缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中。盖好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时

取出，尽快在板上标上展开剂前沿位置。晾干，观察斑点位置，计算rf值。 4、显色

凡可用于纸色谱的显色剂都可用于薄层色谱。薄层色谱还可使用腐蚀性的显色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等。对于含有荧光剂（硫化锌镉、硅酸锌、荧光黄）的薄层板在紫外光下观察，展开后的有机化合物在亮的荧光背景上呈有色斑点。也可用卤素斑点试验法来使薄

层色谱斑点显色。本实验样品本身具有颜色，不必在荧光灯下观察。 柱色谱

1、装柱（湿法） 用镊子取少许脱脂棉放于干净的色谱柱底部，轻轻塞紧，关闭活塞，向柱中倒入溶剂至约为柱高的3/4处，通过一干燥的玻璃漏斗慢慢加入色谱柱用中性氧化铝，打开活塞，控制流出速度为1滴/秒；并用橡皮塞轻轻敲打色谱柱下部，使填装紧密，当装柱至3/4时，再在上面加一片小圆滤纸或脱脂棉。操作时一直保持上述流速注意不能使液面低于氧化铝的上层。 2、上样

当溶剂液面刚好流至滤纸面时，立即沿柱壁加入待分离样品溶液，当此溶液流至接近滤

纸面时，立即用少量溶剂洗下管壁的有色物质，如此连续2—3次，直至洗净为止。 3、洗脱

用已配好的溶剂（学生自己配制）洗脱，控制流出速度。整个过程都应有洗脱剂覆盖吸附剂。极性小的色带首先向下移动，极性较大的留在柱的上端，形成不同的色带。观察色带

的出现，并用锥形瓶收集洗脱液。 三、实验关键及注意事项： 1、薄层层析时，薄层板的制备要厚薄均匀，表面平整光洁。 2、点样时，各样点间距1—1.5cm，样点直径应不超过2mm， 3、柱层析时，柱子要致密紧实，无气泡。

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