柱层析实验报告(2)

xiazanwen(金币+5):辛苦了 2010-08-24 06:34:58 枫叶子2006:编辑内容 2010-10-24 17:10 柱层析

利用层析柱将混合物各组分分离开来的操作过程称为柱层析。柱层析是层析技术中的一类，依据其作用原理又可分为吸附柱层析、分配柱层和离子交换柱层析等。其中以吸附柱层析应用最广。以下只介绍吸附柱层析的相关问题，其操作方法也可作为其他类型柱层析的参

考。? 1.吸附柱层析的器材? (1)层析柱?

实验室中所用的玻璃层析柱有两种形式：一是下部带有活塞的玻璃管，活塞的芯最好是聚四氟乙烯制作的，这样可以不涂真空油脂，以免污染产品。如果使用普通的玻璃活塞，则真空油脂要小心地涂薄涂匀。另一种是将玻璃管下端拉细，套上一段弹性良好的管子。这段管子必须是不能被淋洗剂溶解的，普通橡皮管一般不可充作此用，因为橡皮易被氯仿、苯、thf等溶剂溶胀，而聚乙烯管子对大多数溶剂是惰性的，所以常常使用。用一只螺旋夹控制流速，此外，薄膜塑料柱因使用方便、节省淋洗剂、减少蒸发量等优点，应用日趋广泛。薄膜塑料柱总是以扁平成卷保存的，两侧常有很深的折痕。使用前需将裁取的一段薄膜管一端扎紧，另一端套在一段玻璃管上并用棉线扎紧。将这段玻璃管穿过一个单孔塞。然后将薄膜管放进一根又粗又长，下端拉细了的玻璃管内，使塞子塞紧大玻璃管的口。用水泵自大玻璃管下端抽气，薄膜柱即因内部压强大于外部而自行展圆。待装入吸附剂后在其下部扎几个小

孔即可使用。?

层析柱的尺寸根据被分离物的量来确定，其直径与高度之比则根据被分离混合物的分离难易而定，一般在1∶8到1∶50之间。柱身细长，分离效果好，但可分离的量小，且分离所需时间长；柱身短粗，分离效果较差，但一次可以分离较多的样品，且所需时间短。如果待分离物各组分较难分离，宜选用细长的柱子，如果要处理大量的较易分离的或对分离纯度要求较低的混合物，则可选用粗而短的柱子。最常使用的层析柱，直径与长度之比在1∶8 到1∶15 之间。?

(2)吸附剂?

柱层析中最常使用的吸附剂是氧化铝或硅胶。其用量为被分离样品的30～50倍，对于难以分离的混合物，吸附剂的用量可达100倍或更高。对于吸附剂应综合考虑其种类、酸碱性、

粒度及活性等因素，最后用实验方法选择和确定。?

市售氧化铝有酸性、碱性和中性之分。酸性氧化铝是用1%盐酸浸泡后，用蒸馏水洗到其浸出液的ph值为4，适用于分离酸性物质；碱性氧化铝浸出液的ph值为9～10，用以分离胺类、生物碱及其他有机碱性化合物。中性氧化铝的相应ph值为7.5，适合于醛、酮、醌、酯等类化合物的分离以及对酸、碱敏感的其他类型化合物的分离。硅胶没有酸碱性之分，可适

用于各类有机物的分离。?

柱层析所用氧化铝的粒度一般为100～150目，硅胶为60～100目，如果颗粒太小，淋洗

剂在其中流动太慢，甚至流不出来。? 氧化铝和硅胶的活性各分五个等级。哪个活性级别分离效果最好，要用实验方法确定，而不是盲目选择高的活性级别，最常使用的是ⅱ～ⅲ级。如果吸附剂活性太低，分离效果不好，可通过“活化”来提高其活性。所谓“活化”就是指用加热的方法除去吸附剂所含的水分，提高其吸附活性的过程。通常是将吸附剂装在瓷盘里放进烘箱中恒温加热。“活化”的温度和时间应根据分离需要而定。氧化铝一般在200℃恒温4h，硅胶在105～110℃恒温0.5～1h。“活化”完毕，切断电源，待温度降至接近室温时，从烘箱中取出放进干燥器中备用。有的样品在活性高的吸附剂中分离效果不好，可将吸附剂放在空气中让其吸收一些水分，分离

效果反而好一些。?

此外，一些天然产物带有多种官能团，对微弱的酸碱性都很敏感，则可用纤维素、淀粉

或糖类作吸附剂。活性碳是一种吸附能力很高的吸附剂，但因粒度太小而不常用。 (3)淋洗剂?

淋洗剂是将被分离物从吸附剂上洗脱下来所用的溶剂，所以也称为洗脱剂或简称溶剂。其极性大小和对被分离物各组分的溶解度大小对于分离效果非常重要。如果淋洗剂的极性远大于被分离物的极性，则淋洗剂将受到吸附剂的强烈吸附，从而将原来被吸附的待分离物“顶替”下来，随多余的淋洗剂冲下而起不到分离作用；如果淋洗剂的极性远小于各组分的极性，则各组分被吸附剂强烈吸附而留在固定相中，不能随流动相向下移动，也不能达到分离的目的。如果淋洗剂对于被分离物各组分溶解度太大，被分离物将会过多、过快地溶解于其中并被迅速洗脱而不能很好地分离；如果溶解度太小，则会造成谱带分散，甚至完全不能分开。常用溶剂的极性大小次序也因所用吸附剂的种类不同而不尽相同，很多资料给出了在硅胶和氧化铝柱中常用溶剂所表现出的极性次序，可作为选择溶剂的参考，首先在薄层层析板上试选，初步确定后再上柱分离。如果所有色带都行进甚慢则应改用极性较大溶解性能也较大的

溶剂，反之则改用极性和溶解性都较小的溶剂，直至获得满意的分离效果。?

除了分离效果外还应当考虑：①在常温至沸点的温度范围内可与被分离物长期共存不发生任何化学反应，也不被吸附剂或被分离物催化而发生自身的化学反应；②沸点较低以利回收；③毒性较小，操作安全；④适当考虑价格是否合算，来源是否方便；⑤回收溶剂一般不

应作为最终纯化产物的淋洗剂。?

淋洗剂的用量往往较大，故最好使用单一溶剂以利回收。只有在选不出合适的单一溶剂时才使用混合溶剂。混合溶剂一般由两种可以无限混溶的溶剂组成，先以不同的配比在薄层板上试验，选出最佳配比，再按该比例配制好，像单一溶剂一样使用。如果必须在层析过程中改变淋洗剂的极性，不能把一种溶剂迅速换成另一种溶剂，而应当将极性稍大的溶剂按一定的百分率逐渐加到正在使用的溶剂中去，逐步提高其比例，直至所需要的配比。一条经验规律称为“幂指数增加”，例如，原淋洗剂为环己烷，如欲加入二氯甲烷以增加其极性，则不应立即换为二氯甲烷，而应使用这两种溶剂的混合液，其中二氯甲烷的比例依次为5%，15%，45%，最后再换为纯净的二氯甲烷。每次加大比例后，须待流出液量为吸附剂装载体积的3倍时再进一步加大比例。这只是一般方法，其目的在于避免后面的色带行进过快，追上前面

的色带，造成交叉带。但如果两色带间有很宽阔的空白带，不会造成交叉，则亦可直 接换成后一种溶剂，所以应根据具体情况灵活运用。? (4)被分离的混合物?

在实际工作中，被分离的样品是不能选择的，但认真考察各个组分的分子结构，估计其吸附能力，对于正确选择吸附剂和淋洗剂都是有益的。若化合物的极性较大，或含有极性较大的基团，则易被吸附而较难被洗脱，宜选用吸附力较弱的吸附剂和极性较大的淋洗剂。反之，对于极性较小的样品则选用极性较强的吸附剂和弱极性或非极性淋洗剂。若各组分极性差别较大，则易于分离，可选用较为短粗的柱子，使用较少的吸附剂；若各组分极性相差甚

微，则难于分离，宜选用细长的柱子并使用较大量的吸附剂。? (5)其他物品?

储存淋洗剂的分液漏斗一只，接收洗出液的锥形瓶若干只，其容积大小根据淋洗剂的体积确定。玻璃毛少量，白沙少量，各自洗净烘干。若层析柱很小，也可用少量脱脂棉代替玻

璃毛。? 2.吸附柱层析的操作? (1)装柱? 装柱的方法分湿法和干法两种。?

湿法装柱时，将柱竖直固定在铁支架上，关闭活塞，加入选定的淋洗剂至柱容积的1/4 ，用一支干净的玻璃棒将少量玻璃毛(或脱脂棉)轻轻推入柱底狭窄部位，小心挤出其中的气泡，但不要压得太紧密，否则淋洗剂将流出太慢或根本流不出来。将准备好的白沙加入柱中，使在玻璃毛上均匀沉积成约5mm厚的一层。将需要量的吸附剂置烧杯中，加淋洗剂浸润，溶胀并调成糊状。打开柱下活塞调节流出速度为每秒钟1滴，将调好的吸附剂在搅拌下自柱顶缓缓注入柱中，同时用套有橡皮管的玻璃棒轻轻敲击柱身，使吸附剂在淋洗剂中均匀沉降，形成均匀紧密的吸附剂柱。吸附剂最好一次加完。若分数次加，则会沉积为数层，各层交接处的吸附剂颗粒甚细，在分离时易被误认为是一个色层。全部吸附剂加完后，在吸附剂沉积面上盖一层白沙(如柱很小，也可不用白沙而盖上一张直径与柱内径相当的滤纸片)，关闭活塞。在全部装柱过程及装完柱后，都需始终保持吸附剂上面有一段液柱，否则将会有空气进入吸附剂，在其中形成气泡而影响分离效果。如果发现柱中已经形成了气泡，应设法排除，若不

能排除，则应倒出重装。装好的吸附柱各层材料的分布见图3-36。?

干法装柱时，先将柱竖直固定在铁支架上，关闭活塞。加入溶剂至柱容积的3/4，打开活塞控制溶剂流速为1滴/秒，然后将所需量的吸附剂通过一支短颈玻璃漏斗慢慢加入柱中，同时，轻轻敲柱身使柱填充紧密。干法装柱的缺点是容易使柱中混有气泡。特别是使用硅胶为吸附剂时，最好不用干法装柱，因为硅胶在溶剂中有一溶胀过程，若采用干法装柱，硅胶

会在柱中溶胀，往往留下缝隙和气泡，影响分离效果，甚至需要重新装柱。?

装填薄膜塑料柱时，可先用抽气法将薄膜展开成圆柱形，在底部装入一段玻璃毛，吸附剂通过一个粗颈漏斗自柱顶装入。装至1/3处，将柱身在坚硬的表面上礅结实，再装入1/3， 再礅结实，直至装到需要的高度。装成的薄膜柱应紧密结实，可以像玻璃柱那样用夹子

夹住，再在其底部扎一些小孔即可使用。(2)加样?

加样亦有干法、湿法两种。湿法加样是将待分离物溶于尽可能少的溶剂中，如有不溶性杂质应当滤去。打开柱下活塞小心放出柱中液体至液面下降到滤纸片处，关闭活塞，将配好的溶液沿着柱内壁缓缓加入，切记勿冲动吸附剂，否则将造成吸附剂表面不平而影响分离效果。溶液加完后，小心开启柱下活塞，放出液体至溶液液面降至滤纸片时，关闭活塞，用少许溶剂冲洗柱内壁(同样不可冲动吸附剂)，再放出液体至液面降到滤纸处，再次冲洗柱内壁，直至柱壁和柱顶溶剂没有颜色。加样操作的关键是要避免样品溶液被冲稀。在技术熟练的情

况下，也可以不关下部活塞，在每秒钟1滴的恒定流速下连贯地完成上述操作。?

干法加样是将待分离样品加少量低沸点溶剂溶解，再加入约5倍量吸附剂，拌和均匀后在通风橱中蒸发至干。揭去柱顶滤纸片，将吸附了样品的吸附剂平摊在柱内吸附剂的顶端，在上面加盖滤纸片或加盖一层白沙。干法加样易于掌握，不会造成样品溶液的冲稀，但不适

合对热敏感的化合物。? (3)淋洗和接收?

样品加入后即可用大量淋洗剂淋洗。随着流动相向下移动，混合物逐渐分成若干个不同的色带，继续淋洗，各色带间距离拉开，最终被一个个淋洗下来。当第一色带开始流出时，更换接收瓶，接收完毕再更换接受瓶，接受两色带间的空白带，并依此法分别接收各个色带。若后面的色带下行太慢，可依次使用几种极性逐渐增大的淋洗剂来淋洗。为了减少添加淋洗剂的次数，可用分液漏斗在柱顶“自动”添加。分液漏斗的活塞打开，顶塞密封，尾部插进柱上部的淋洗剂液面以下，当液面下降后，漏斗尾部露出，即有空气泡自尾部进入分液漏斗，这就加大了漏斗内液面上的压力，漏斗内的淋洗剂就自动流入柱内，使柱内液面上升，当液面淹没漏斗尾部时，就不再有空气进入漏斗，漏斗内的淋洗剂就不再流出。在使用薄膜塑料柱进行层析时，一旦色带形成并拉开距离，可将柱吸干，用刀沿“空白带”处切开，将各色

带分别萃取，各自蒸去溶剂，即得到相应组分的化合物。? (4)显色?

分离无色物质时需要显色。如果使用带萤光的吸附剂，可在黑暗的环境中用紫外光照射以显出各色带的位置，以便按色带分别接收。但柱上显色远不如在薄层板上显色方便。所以常用的办法是等分接收，即事先准备十几个甚至几十个接收瓶，依次编出号码，各接收相同体积的流出液，并各自在薄层板上点样展开，然后在薄层板上显色(相关的显色操作见薄层层析部分)。具有相同rｆ值的为同一组分，可以合并处理。也可能出现交叉带，若交叉带很少，可以弃之，若交叉带较多，或样品很贵重，可以将交叉部分再次作柱层析分离，直至完全分

开。 3.柱层析操作中应注意的问题?

(1)要控制淋洗剂流出的速度。一般控制流速为1滴/秒。若流速太快，样品在柱中的吸

附和溶解过程来不及达到平衡，影响分离效果。若流速太慢，分离时间会拖得太长。有时， 样品在柱中停留时间过长，可能促成某些成分发生变化。或流动相在柱中下行速度小于

样品的扩散速度，会造成色带加宽、交合甚至根本不能分离。? (2)以下现象会严重影响分离效果，必须尽力避免。?

a.色带过宽，界限不清。造成的原因可能是柱的直径与高度比选择不当，或吸附剂、淋洗剂选择不当，或样品在柱中停留时间过长。但更常见的却是在加样时造成的。若在样品溶液加进柱中后，没有打开下部活塞放出淋洗剂使样品溶液降至滤纸片处，即急于加溶剂冲洗柱壁，造成样品溶液大幅度稀释，或过早加大量溶剂淋洗，必然会造成色带过宽。所以溶样

时一定要使用尽可能少的溶剂，加样时一定要避免样品溶液的稀释。?

b.色带倾斜。正常情况下柱中的色带应是水平的，而倾斜的色带，在前一个色带尚未完全流出时，后面色带的前沿已开始流出，所以不能接收到纯粹的单一组分。造成色带倾斜的

原因是吸附剂的顶面装得倾斜，或柱身安装得不垂直。?

c.气泡。造成气泡的原因可能是玻璃毛或脱脂棉中的空气未挤净，其后升入吸附剂中形成气泡，也可能是吸附剂未充分浸润溶胀，在柱中与淋洗剂作用发热而形成，但更大量的是在装柱或淋洗过程中淋洗剂放出过快，液面下降到吸附剂沉积面之下，使空气进入吸附剂内部滞留而成。当柱内有气泡时，大量淋洗剂顺气泡外壁流下，在气泡下方形成沟流，使后一色带前沿的一部分突出伸入前一色带，从而使两色带难于分离。所以在装柱及淋洗过程中应

始终保持吸附剂上面有一段液柱。?

d.柱顶面填装不平。这时色带前沿将沿低凹处向下延伸进入前面的色带，这也是一种沟

流。?

e.断层和裂缝。当柱内某一区域内积有较多气泡时，这些气泡会合并起来在柱内形成断

层或裂缝。裂缝造成的沟流，而断层相当于一个不平整的装载面。 1语源学2类别3基本原理4几种常用的层析 语源学 chrome意为“色彩”，graphy源自希腊文，意为“写”。色谱为层析的同义语，都是从英

语chromatography译来的。

层析（色谱） chromatograpby 在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中，使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。根据移动相种类的不同，分为液体层析、气体层析二种。用作固定相的有矽胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体，也可使用其他物质。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatogra-phy），在玻璃板上涂上一层薄而均的物质作为固定相的称为薄层层析（thin-layer chromatography），

篇四：凝胶层析试验报告 摘要 凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（gfc）和凝胶渗透色谱（gpc）。 gfc一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。本实验用凝

胶色谱法对食用油中的甘油三酯进行了分离提取。 关键词：凝胶色谱 甘油三酯 食用油 第一章 简介 凝胶层析法凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。

一 、凝胶的选择 根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用sephadex g-25和g-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用sephadex g-10，g-15及bio-gel-p-2或4。如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程

中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于kd不同，最后得到分离。 二、 柱的直径与长度 根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严

重。长度l与直径d的比值l/d一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。 三、凝胶柱的制备 凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶

浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。 凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，

拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床 表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平

整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。 四、加样和洗脱 凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5％-10％。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2。样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。

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