CRISP原理(3)

新技术改善CRISPR/Cas9系统的准确率

在2013年6月，来自麻省总医院的研究人员发现使用CRISPR-Cas RNA引导性核酸酶的一个重要局限：会在预期靶点以外的位点上生成多余的DNA突变。另有研究直接说明了CRISPR/Cas9存在严重的脱靶性，即该技术可以发生非特异性切割，引起基因组非靶向位点的突变，这样会造成研究结果的不确定性以及研究工作的大量增加，这一问题严重地限制了Cas9 的应用。

1、ChIP-seq方法

在2014年6月，弗吉尼亚大学医学院的研究人员设计出一种方法，可检测风靡科学界的CRISPR/Cas9基因编辑系统中意想不到的副作用，相关研究结果发表在《Nature Biotechnology》。1个月后，中国医学科学院和北京生命科学研究所（NIBS）的研究人员，在《Cell Research》发表的一项研究中，利用一种公正的全基因组ChIP-seq方法，分析了人类基因组中CRISPR/Cas9的结合脱靶效应。新年伊始，美国希望之城贝克曼研究所和浙江大学第一附属医院的研究人员在《Nature Biotechnology》描述了一种新策略，有望帮助科学家检测基因组编辑技术中的脱靶效应。

2、Digenome-seq方法

2015年2月9日，来自韩国首尔大学、首尔基础科学研究所等机构的研究人员在Nature旗下子刊《Nature Methods》发表一项研究，成功证实CRISPR-Cas9在人类细胞中有精确的打靶作用，他们开发出一种强大、敏感、无偏见和具有成本效益的方法——Digenome-seq，可在全基因组范围内检测人类细胞中的CRISPR/Cas9脱靶效应。

在这项研究中，虽然RNA引导的、通过CRISPR-Cas9系统的基因组编辑已经被广泛应用于生物医学研究，但是Cas9核酸酶的全基因组靶向特异性仍然是有争议的。为此，他们提出一种方法Digenome-seq，利用基因组测序查找CRISPR-Cas9可能突变产生的打靶和脱靶序列。他们用Cas9核酸酶在试管中消化人类基因组 DNA，然后进行全基因组测序。这种体外消化可产生打靶和脱靶序列的独特模式，可以通过计算确定。此外，在sgRNA末端添加组成CRISPR-Cas9的鸟嘌呤核苷酸，研究人员成功地制备了这种高度发达的可编程核酸酶，在人类基因组中它没有可测量的脱靶效应。

Jin-Soo Kim表示：―如果CRISPR-Cas9可缩短脱靶的DNA序列，它就可能诱导多余的突变。因为我们成功证实了CRISPR-Cas9的精确度，我们认为，这将推动基因或细胞治疗的发展。‖

研究人员还表示，Cas9核酸酶可能是高度特异性的，从而诱导整个基因组中仅仅几个（而不是数千）位点的脱靶突变，而且Cas9脱靶效应可通过用改性sgRNAs替换―混杂‖单导RNAs（sgRNAs）而得以避免。总而言之，Digenome-seq是一种强大的、敏感的、无偏见的和具有成本效益的方法，可分析编程核酸酶（包括Cas9）的全基因组脱靶效应。

参考文献Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells

3、CRISPR/Cas9-pDBD

美国麻省大学医学院的科学家开发的新型CRISPR/Cas9技术可以足够精确地在几乎任何基因组的位点处对DNA进行切割，同时还可以避免潜在的在标准CRISPR基因编辑技术中发现的有害的脱靶性改变，近日，研究者通过将CRISPR/Cas9系统同可编程的DNA结合结构域（CRISPR/Cas9-pDBD）相结合，开发出了一种附加的校对步骤，其可以有效改善基因编辑系统的精确性，同时为开发潜在的基因疗法提供希望，相关研究刊登于国际杂志Nature Methods上。

研究者Scot Wolfe博士表示，标准的CRISPR/Cas9系统善于在体外利用单链引导的RNA来对基因组进行切割，理想状况下这种技术可以应用于大部分的基因疗法中，包括对大量细胞进行编辑来尽可能减小对基因组的附带损伤；文章中研究人员给CRISPR/Cas9系统中添加了一种额外的校对步骤，通过将锌指DNA结合结构域融入到CRISPR/Cas9系统中就可以明显改善CRISPR/Cas9系统的精确性，大约可以改善大约100倍的精确性。

如今研究人员正在开发新型的核酸酶平台用于切除感染细胞中潜在的HIV原病毒，同时修饰引发慢性肉芽肿病的遗传突变。文章中科学家们利用人工引导的RNAs来对CRISPR/Cas9进行重编程从而清除哺乳细胞基因组中的特殊序列，也可以在细胞的遗传信息中插入新的片段，因此CRISPR/Cas9系统是一项革命性的医学进步，其可以很容易地对细胞中的基因进行失活的活化操作。

锌指结构域是一种特殊蛋白，其可以被工程化操作结合到基因组的特殊区域中，通过将DNA结合的锌指结构域同RNA引导的CRISPR/Cas9系统结合，研究者就可以开发出一种高效高准确率的新型系统；当前研究中研究小组表示，当将二者结合以后，和靶向作用两个不同基因组位点相关的脱靶切割事件大大降低了，而且脱靶切割事件下降将近10倍。因此研究者表示，将DNA结合结构域同CRISPR/Cas9进行结合或许可以开发出一种新型平台来减少基因疗法给患者所带来的潜在风险。研究者目前正在开发修饰化的Cas9来在造血干细胞中直接修复引发疾病的突变，用来治疗慢性肉芽肿病患者，他们的最终目的就是将正确的细胞再次插入到患者机体中帮助患者恢复机体免疫功能，从而达到疾病治愈的目的。

进展

在过去两年中，共有大约650篇关于CRISPR/Cas9技术的文章发表，这些论文涉及特殊特征的动物模型，基因编辑相关的疾病，还有基因敲入，可逆敲除，基因激活和表达等多方面领域。而且在如HIV，疟疾，癌症等人类疾病中也有应用。

Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering

在生命科学研究中，一些可以删除、插入和修饰细胞或生物体DNA序列的技术，使得阐析特异基因和调控元件的功能成为可能。多重编辑可进一步实现在更大的规模上调查基因或是蛋白质网络。同样，操控转录调控或是特异位点的染色质状态可以揭示出细胞内遗传物质的组织和利用机制，阐明基因组结构与功能之间的关系。

在生物技术中，精确地操控遗传构件和调控机器还可以推动逆向操控或重建有用的生物系统，例如在工业相关的生物体中提高生物燃料生产信号通路或是构建出抗感染的作物。此外，基因组工程学正在推动新一代的药物研发和医药治疗。同时干扰多个基因可以模拟出作为复杂多基因疾病基础的累加效应，促成新的药物靶点，而基因组编辑则可以在人类基因治疗的背景下直接纠正有害突变。

真核生物基因组包含数以亿计的DNA碱基，因此难于对其进行操控。开发出借助同源重组（HR）的基因打靶技术是基因组操控取得的一个突破。通过操作具种系嵌合能力（germline competent）的干细胞，HR介导的基因打靶促进了生成敲进和敲除动物模型。然而，尽管HR介导的基因打靶可高度精确地改变遗传序列，但目的重组事件的效率却非常低下，给大规模应用基因打靶实验带来了巨大的挑战。

为了克服这些挑战，近年来开发出了一系列基于核酸酶的可编程基因组编辑技术，使得能够靶向性地、高效地改造多种真核生物，尤其是哺乳动物物种。在当前的基因组编辑技术中，发展最快的就是一类称作为Cas9的RNA引导核酸酶，其来自于细菌的适应性免疫系统CRISPR,借助于短RNA分子的引导Cas9可以轻易地靶向几乎所有的基因组选择位点。

CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes 研究人员指出CRISPR技术可以用于真核细胞转录调控研究，CRISPRi可以作为真核细胞基因表达精确调控的一种通用工具。

此前这一研究组发现当缺失核酸内切酶活性的Cas9与一种导向RNA共表达时候，会产生一种DNA识别复合物，这种复合物能特异性干扰转录延伸，RNA聚合酶结合，或转录因子结合。研究人员将这个系统称为CRISPR干扰（CRISPRi），指出这一系统能有效抑制大肠杆菌中靶向基因的表达，并且不会出现脱靶效应。而且利用CRISPRi，还可以同时抑制多个靶基因，这种作用也是可逆。

在这一基础上，研究人员进一步发现在不同的调控功能元件的效应位点，加入dCas9，能促进其稳定和有效转录的抑制或激活，这一点在人类和酵母细胞中都得到了证实。同时将dCas9耦合到转录抑制结构域还能极大的增强多个内源性基因的表达沉默。此外研究人员还利用RNA-seq分析表明，CRISPR干扰（CRISPRi）介导的转录抑制特异性很高。

这些研究数据均表明，研究人员建立的CRISPR系统可以作为一个模块化，灵活的DNA结合平台，用于针对靶向DNA序列蛋白召集，这也表明CRISPRi可以作为真核细胞基因表达精确调控的一种通用工具。

One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering

这项研究实现了一步操控小鼠基因组纳入了报告基因和条件性等位基因，现在生成包含如此复杂工程等位基因的动物只需数周而非数年的时间，并可利用这些动物来构建疾病模型及研究基因功能。

参考文献：

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