CRISP原理

CRISPR/Cas9 基因敲除技术

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9 系统应用最为广泛。在这一系统中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与转录激活crRNA（trans-activating RNA，tracrRNA）退火结合形成双链RNA能特异性识别基因组序列，Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。Cas9 首先与crRNA 及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM 序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA 复合结构，进而对目的DNA 双链进行切割，生成DNA 双链断裂（double-strand breaks, DSBs）。在基因组编辑过程中，tracrRNA和crRNA可以融合成为1条RNA（sgRNA）表达同样可以起到靶向剪切的作用。

通过基因工程手段对crRNA 和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA

（singleguide RNA）。融合的RNA 具有与野生型RNA 类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9 的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作。

由于PAM 序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。

与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases,TALEN）相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相似甚至更高的效率。

CRISPR/Cas9 系统可广泛应用于基因组工程，如基因抑制，基因敲除，基因敲入，基因修复等。CRISPR-Cas9 体系的RNA-DNA 识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。其最重要的优势是Cas9 蛋白可在多个不同的gRNA 的引导下同时靶向多个基因组位点，起到多靶点调控的作用。

起源：

1、2007年，来自丹尼斯克公司（一家总部位于丹麦哥本哈根的食品添加剂公司，目前被杜邦公司收购）的科学家找到了一种能增强细菌防御噬菌体能力的方法。

2、2013年，四个研究团队报告了这一被称为CRISPR的系统，自此CRISPR技术红红火火的发展了起来，许多科研团队利用它来删除、添加、激活或抑制人体、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞中的目标基因。

3、2015年，蒙大拿州立大学的两位学者以―CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems‖为题，介绍了CRISPR-Cas免疫应答系统。

其中Blake Wiedenheft就是当年加州大学伯克利分校Jennifer Doudna研究组成员，他们曾于2010年破解了Csy4核糖核酸内切酶原子水平的晶体结构模型——研究人员确定Csy4是一种存在于原核细胞的酶，它能够启动生成CRISPR衍生RNAs (crRNAs)，这种小RNA分子能够靶向并沉默侵入的病毒和质粒。

CRISPR 与RNAi 的区别

目前已经广泛应用的RNAi 技术的靶标是mRNA，而CRISPR 通过RNA 识别DNA 序列然后再改变DNA 序列，是可以遗传的。由于编码mRNA 的DNA 序列只占总DNA 的极少部分，因此靶向DNA 序列的CRISPR 的靶标要比RNAi 广得多，更有可能筛选出针对某DNA 序列的特异CRISPR 靶标。

CRISPR/Cas9特点和缺点：

CRISPR/Cas9的优点是操作简单，对基因组的效率高。需要对某一个靶位点编辑的时候，只需要表达相应的sgRNA即可，不需要对Cas9核酸酶进行改造。它可对任何物种的基因组进行高效率的定向编辑。

1、操作简单，靶向精确性更高。

sgRNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9 才会对DNA 进行剪切。编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs 和ZENs更简单方便，用于CRISPR 的sgRNA识别序列仅需20 个核苷酸。

2、CRISPR/Cas9 系统是由RNA 调控的对DNA 的修饰，其基因修饰可遗传。 3、基因修饰率高，基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等 4、可实现对靶基因多个位点同时敲除。 5、无物种限制。

6、实验周期短，最快仅需2个月，节省大量时间和成本。

基因组编辑技术的一个缺点是脱靶效应，可能在靶点以外的地方切断DNA，产生indel。

CRISPR-Cas系统三个主要阶段

细菌和古细菌进化出了复杂的CRISPR适应性免疫系统，这一系统可以分成I-III三个类型，至少有11种不同的亚型：从I-A到I-F，从II-A到II-C，以及III-A和III-B。其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR 相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。

不过尽管有这些不同，所有的CRISPR-Cas系统都通过三个主要阶段来完成功能：采集，CRISPR RNA(crRNA) 生物合成，靶向干扰。

阶段1：外源DNA采集

外源核苷酸是通过Cas蛋白来识别的，入侵的短片段DNA（30-50个碱基对）被称为protospacers，作为间隔序列插入宿主CRISPR位点中，由重复序列隔开。对于I型和II型系统来说，protospacers来自入侵DNA中两侧出现2-5个核酸结构（PAM，protospacer adjacent motif）的区域。一般protospacers连接在CRISPR 位点的一端，并且后者通过涉及Cas1、Cas2和游离3’-hydroxyls等元件的机制，牵引序列。Protospacer的整合过程中也出现了牵引末端重新序列复制，这可能涉及宿主聚合酶和DNA修复机制。

相关论文解析： Multiple mechanisms for CRISPR–Cas inhibition by anti-CRISPR proteins 研究人员确定了其中三种anti-CRISPR蛋白：AcrF1、AcrF2和AcrF3的功能机制。他们对这些蛋白进行了生物化学及体内研究，证实每一个anti-CRISPR蛋白都通过不同的机制来抑制了CRISPR–Cas的活性。有两个anti-CRISPR阻断了CRISPR–Cas复合物的DNA结合活性，但它们是通过与不同的蛋白质亚基互作，利用了空间或非空间抑制模式来做到这一点的。第三种anti-CRISPR蛋白通过结合Cas3解螺旋酶-核酸酶，阻止其招募到结合DNA的CRISPR–Cas复合物上来起作用。在体内，这一anti-CRISPR可以将CRISPR–Cas系统转变为转录遏制物，首次证实了一种蛋白质相互作用蛋白可以调控CRISPR–Cas活性。作者们认为，这些anti-CRISPR蛋白质不同的序列及作用机制表明了独立的进化，并预示了还存在其他的方式—蛋白质借助于它们改变了CRISPR–Cas的功能。

新研究首次探讨了蛋白质抑制CRISPR–Cas系统的机制。这些多样且不同的机制反映了病毒-宿主军备竞赛深层的进化根源。这些已知和尚有待发现的Anti-CRISPR，将为认识和操控CRISPR–Cas系统提供大量有价值的工具。其中一个例子就是，新研究发现AcrF3通过阻止招募Cas3将CRISPR–Cas系统转变为了一个基因调控因子。由于除了破坏外源DNA，CRISPR–Cas系统来执行着各种功能，许多重要的功能有可能是由与CRISPR–Cas元件互作，

由此改变了这一系统活性的蛋白质来完成。

生物谷推荐的英文原文SnapShot： CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems

阶段2：crRNA合成

CRISPR RNA生物合成在转录之后，生成初级转录产物：pre-crRNA，之后经过加工，又成为一组短小的CRISPR 衍生RNAs（crRNAs），这些crRNAs每一个都包含有对应于之前遇到的外源DNA的对应序列。

CrRNAs导向序列两端是相邻重复序列区域，在I型和II型系统中，这种CRISPR转录产物会被CRISPR特异性核酸内切酶（Cas6 或 Cas5d）切割，切割位点位于重新序列。许多I型系统的重新序列会出现多次，因此Cas6也需要稳定连接在crRNA 3’端茎环上。对于III型系统来说，Cas6则是短暂连接，crRNA 3’端会进一步通过未知的酶处理。

II型系统中，CRISPR RNA加工过程则取决于反式作用 crRNA (tracrRNA)，tracrRNA包含一个重复序列的互补序列，这些双螺旋区域在Cas9出现时可以通过RNase III 进行处理。

相关论文解析：CRISPR-mediated adaptive immune systems in bacteria and archaea.

这篇发表在Annu. Rev. Biochem. 杂志上的文章十分重要，解析了crRNA合成过程，以及其后的靶向干扰中的几个重要步骤，此后也被多人引用。

Development and applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering

张锋的这篇综述概述了CRISPR/Cas9作为一种平台技术的开发状况以及在基因组编辑方面的应用，也讨论了其存在的一些挑战，以及未来的创新之路。

阶段3：靶向干扰

成熟的crRNAs能指导Cas蛋白靶向互补靶标，靶标序列由专用Cas核酸酶降解，但其靶标降解的机制存在差异。I型和II型系统都可以靶向包含PAM和protospacer互补序列的dsDNA底物。III型系统则不依赖于 PAM作为识别序列，而是通过导向序列延伸至crRNA信号5'handle的核苷酸进行识别（CRISPR位点包含与导向序列，5'handle互补的序列），并阻止靶向切割。

相关论文解析：Co-transcriptional DNA and RNA Cleavage during Type III CRISPR-Cas Immunity

一些数据表明，当病毒入侵细菌细胞时，称作为III型CRISPR-Cas的这一机制会靶向病毒的DNA，阻止它利用细菌的机器来拷贝自身及感染更多的细菌。但另外的一些实验表明，III型CRISPR-Cas只能通过切割病毒RNA来让病毒丧失能力。

洛克菲勒大学的研究人员他们检测了III型CRISPR-Cas对DNA和RNA的切割，结果发现了从前其他人没有得到过的一个关键成分，并发现CRISPR-Cas确实切割了病毒DNA生成的RNA，但它也切割了病毒的DNA。

这种双交叉系统有一些优势。许多的病毒整合到它们感染细胞的基因组中保持休眠状态，不会造成损伤。事实上，这些病毒对于细菌可能是有益的，例如它们携带的毒素帮助了细菌促进自身生存。举例说来，白喉毒素是由一种细菌所分泌，但编码这一毒素的基因却来自于一种病毒。只有在病毒开始将它们的DNA转录为RNA之时才会让它们丧失功能，通过设置这样的要求III型CRISPR-Cas不会损及休眠病毒，使得它们可以继续让宿主细菌受益。

循环关闭

I型系统中，监测复合物中靶向结合会导致Cas3介导的靶向降解（直接干扰）或最初采集，这其中涉及crRNA导向募集Cas3、Cas1 和Cas2到外源DNA处，引起新一轮的快

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