第14章 遗传病诊断(6)

因未知，可选择与疾病连锁的多态性连锁分析（Amp-FLP连锁分析，SSCP连锁分析，RFLP位点单体型连锁分析）；若基因已知但异常不明，可选择与标记座位连锁的多态性连锁分析（SSCP连锁分析，Amp-FLP连锁分析，RFLP连锁分析）。

应注意正确选择诊断方案和正确的诊断方法。在诊断过程中具体要注意的问题包括：基因的多效性、不规则显性、遗传异质性、新发生的突变、遗传印迹、动态突变等遗传学问题。

14．基因诊断和传统的诊断方法的主要差异在于直接从基因型推断表型，即越过基因产物直接检查基因的结构而做出产前或发病前的早期诊断。此外基因诊断还具有不受取材的细胞类型和发病年龄的限制，也不受基因表达的时空限制。例如苯丙氨酸羟化酶基因（PAH）就不在羊水和绒毛细胞中表达所以用一般的方法就无法在产前检测。而用基因诊断方法就可以准确无误地检测该基因的缺陷从而做出产前诊断。

15．染色体检查适应证可归纳为下列几个方面：①智能低下、生长迟缓或伴有其他先天畸形者；②夫妇中有染色体异常，如平衡结构重排、嵌合体等；③家族中已发现染色体异常或先天畸形个体；④多发性流产的妇女及其丈夫；⑤原发闭经和男女不育症者；⑥34岁以上的高龄孕妇；⑦有两性内外生殖器畸形者。⑧身材高大，性情粗暴的男性；⑨恶性血液病患者；⑩长期接受X线、电离辐射的人员。

16．酶和蛋白质的定性和定量分析可反映基因结构的改变，是诊断单基因病的主要方法之一，由于主要采用生化手段故称之为生物化学检查。生化检查主要是对蛋白质和酶结构或功能活性的检测。此外还包括了反应底物、中间产物、终产物和受体与配体的检查。该方法特别适用于分子病、先天性代谢缺陷、免疫缺陷等遗传病的检查。生化检查可用于先天性代谢病的产前诊断和新生儿代谢病的筛查。产前诊断中常采集绒毛、羊水、脐带血和皮肤等进行分析。新生儿的筛查最常用的标本是血和尿。生化检查可以分为两个方面：

(1)酶和蛋白质的分析：利用血液和特定的组织，细胞对酶的活性和蛋白质的含量进行检测。主要方法有：电泳技术，酶活性检测，层析技术，免疫技术，氨基酸顺序分析技术等。临床上经常应用的生物化学检测方法是检测酶的缺陷和代谢中间产物。

(2)代谢产物的检测：利用血液，尿液和羊水对代谢产物进行质和量的检测。主

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要方法有：血液滤纸片法，显色反应等。血和尿液由于易采集，加之在方法学上的不断改进，一直受到检测者的采用，目前已能制成滤纸片和利用显色反应进行检测。苯丙酮尿症、枫糖尿症、同型胱氨酸尿症等氨基酸类代谢病可通过枯草杆菌抑制试验及大肠杆菌代谢物抑制实验等简便的相关生化手段检测待检者的血液滤纸片；一些遗传代谢病患者尿排泄物与三氯化铁显色反应，例如：苯丙酮尿症患者的尿呈绿色，酪氨酸血症患者的尿呈绿色并迅速退色，枫糖尿症患者的尿呈灰绿色，组氨酸血症患者的尿呈 淡绿色，尿黑酸尿症患者的尿则呈深棕色。

17．例如镰形细胞性贫血的基因诊断：已知突变基因是编码β珠蛋白链的第6位密码子由GAG变为GTG，从而使缬氨酸取代了甘氨酸，因此可用如下方法进行诊断。

(1)RFLP诊断：利用限制内切酶MstⅡ(其识别序列与切点为CCTNAGG)消化待测的DNA，正常的β珠蛋白基因（βA）和突变的β珠蛋白基因（βS），其第5～7位密码子序列分别为βA：CCTGAGGAG；βS：CCTGTGGAG，可见βS在第6位密码子由原来的A变成T，从而使MstⅡ不能识别，因而比βA少了一个识别位点。如用β珠蛋白的基因作为探针MstⅡ酶切经Southern 杂交后，βA 出现1.15 kb和0.2kb两个杂交片段，而βS只出现1.35kb一个片段，这样就可根据MstⅡ切点的有无而产生的不同长度的限制性片段来直接对HbS进行基因诊断。

(2)ASO探针诊断：由于突变部位和性质已完全明了，也可以合成寡核苷酸探针，用32p标化来进行诊断。此时需要合成两种探针，一种与正常βa基因序列完全一致，能与之稳定地杂交；另一种与突变基因序列一致，能与βs基因稳定杂交，但不能与正常的βa基因杂交。根据杂交结果，就可以把发生了突变的βs基因检测出来。如用ASO探针在斑点杂交中鉴定基因组DNA标本中的点突变的等位基因，以诊断镰状细胞贫血的β-珠蛋白基因中第6密码子的一单个碱基的替换（A→T），导致GAG（谷氨酸）→GTG（缬氨酸）。

(3)PCR-ASO诊断:PCR技术问世以来，ASO诊断又有新的改进，即先PCR扩增长约110bp的基因片段，然后再与ASO探针杂交。这样可减少目的基因DNA用量，并降低与基因组DNA杂交时的非特异性信号。

18．植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis,PGD）。PGD是指用分子或细胞遗传学技术对体外受精的胚胎进行遗传学诊断，确定正常后再将胚胎植入

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子宫。植入前诊断的基本技术主要涉及三个方面：①胚胎组织微活检：目前多采用在6～8个细胞期，通过显微操作技术取出1～2个细胞进行染色体或基因的检查。②PCR技术：单细胞PCR技术的发展，使GSD能用于临床，该技术主要用于单基因遗传病的诊断。采用引物延伸预扩增（primer extension preamplification,PEP）技术，以随机引物对单个细胞基因组进行全基因扩增，使单个细胞的多位点分析成为可能。另外，荧光PCR也是常用的技术。③FISH技术：该技术利用荧光标记的特定探针与固定在玻片上的卵裂球细胞核进行杂交，在显微镜下鉴定染色体是否存在单体、三体等异常。

19．根据家系中各成员的β-珠蛋白基因等位片段的RFLP表现分析，这个胎儿是患者。其父、母、儿子及胎儿的RFLP位点分别如下：父有长度为6.0 kb和3.0 kb的两条等位片段，母有7.6K b和6.0 Kb两条等位片段，这样即可确定出父的6.0kb等位片段和母的6.0kb等位片段分别均与致病基因相连锁，而父的3.0kb和母的7.6kb等位片段则与正常基因连锁。儿子的等位片段长度为7.6kb和6.0kb，分别来自母亲的7.6kb和父亲的6.0kb(与致病基因相连锁)。说明正常儿子是携带者，而胎儿的等位片段的长度均为6.0kb，是6.0kb的纯合体。分别来自于父的6.0kb等位片段(与致病基因相连锁)和母的6.0kb片段(与致病基因相连锁)，故而确定胎儿是β地中海贫血患者。

（霍满鹏 慕明涛）

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