土壤微生物的分离及鉴定 - 图文(5)

种1支，2号菌种1支，第4支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基4支，分别接1号菌种1支、2号菌种1支，2号菌种1支，第4支不接种，作为对照；

（3）将已接种的和作为对照的8支试管均置37℃中培养1～2d； （4）观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。 吲哚试验

（1）用标签纸在各试管外壁上分别标明培养基的名称和所接种的细菌号；

(2)取4支蛋白胨水培养基试管，分别接1号菌种1支、2号菌种1支，2号菌种1支，第4支不接种，作为对照；

（3）将已接种的和作为对照的4支试管均置37℃中培养1～2d； （4）向蛋白胨水培养基内加入3～4滴乙醚，摇动数次，静置1min，

待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。

配蛋白质水培养基，所用的蛋白胨最好用含色氨酸高的，如用胰蛋白胨水解酪素得到的蛋白胨中色氨酸含量较高。 甲基红试验

（1）用标签纸在各试管外壁上分别标明培养基的名称和所接种的细菌号；

(2)取4支葡萄糖蛋白胨水培养基试管分别接1号菌种1支、2号菌种1支，2号菌种1支，第4支不接种，作为对照； （3）将已接种的和作为对照的4支试管均置37℃中培养1～2d；

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（2）向葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。 11.细菌及霉菌的液体酶活测定 细菌液体酶活测定

(1)种子培养：选取透明圈最大的菌测定液体酶活。从长好的平板上挑取单菌落接种到液体种子试管培养基中，30℃摇床培养1d左右。 (2)发酵培养：按接种量的5%将种子培养基接到发酵产酶培养基摇瓶中，摇瓶为300ml三角瓶，装液量为50ml，30℃培养，每隔12小时取样测酶活。

(3)酶活的测定 采用DNS法，规定每ml果胶酶液降解果胶底物每分钟产生1 μg还原糖为1个酶活单位。 具体方法如下：

绘制标准曲线：配置0.1 mol/L的葡萄糖溶液，然后将其稀释1倍、2倍、3倍和4倍。取2.0 ml稀释液加入3.0 ml DNS，煮沸5分钟，冷却后加水15 ml，再将其稀释5倍，540 nm下测定吸光度。（标准曲线已有）。

样品吸光度测定：吸取0.2 mL适当的稀释酶液于试管中，加1．8 mL、pH 7.0的磷酸盐缓冲液配制的浓度为1％的果胶底物溶液，50℃水浴反应30 min后，立即加入2 mL的DNS终止反应，沸水浴10 min，冷却后蒸馏水定容到12.5 mL，摇匀。

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对照：吸取0.2 mL稀释酶液于试管中，加2 mL的DNS和1.8 mL、pH 7.0的磷酸盐缓冲液配制的浓度为1％的果胶底物溶液，50℃水浴反应30min，沸水浴10 min，冷却后蒸馏水定容到12.5 mL，摇匀。在540 nm下测定其吸光值。 霉菌的液体酶活测定 （1） 种子培养

选取透明圈最大的菌测定液体酶活。从长好的平板上挑取单菌落接种到液体PDA培养基中，30℃摇床培养1d左右。 （2） 发酵培养

按接种量的5%将种子接到发酵培养基摇瓶中，摇瓶为300ml三角瓶，装液量30ml，30℃培养，（一瓶足够测定）。每隔12小时取样1ml测酶活。 （3） 酶活的测定

采用DNS法，酶活力单位定义为: 在上述反应条件下, 每分钟释放相当于1mol N-乙酰氨基葡萄糖( NAG)NAG 所需酶量为1 个酶活力单位(U). 具体方法如下：

样品吸光度测定：① 吸取0.2 mL酶液于试管中，加1.8 mL、pH 7.0的磷酸盐缓冲液配制的浓度为0.5％的几丁质底物溶液，37℃水浴反应30 min后，立即加入2 mL的DNS终止反应，沸水浴10 min，

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冷却后蒸馏水定容到12.5 mL，摇匀。

对照：吸取0.2 mL稀释酶液于试管中，加2 mL的DNS和1.8 mL、pH 7.0的磷酸盐缓冲液配制的浓度为0.5％的果胶底物溶液，37℃静置30min，沸水浴10 min，冷却后蒸馏水定容到12.5 mL，摇匀。在540 nm下测定其吸光值。

标定时用蒸馏水做空白，若吸光度数值超过1.0，需要稀释后测定结果。

将测定结果减去对照则为酶活数据，吸光度越大，表示酶活越高，根据标准曲线将吸光度换算为酶活单位。

12.查阅《伯杰氏系统细菌学手册》对所分离纯化的细菌定属。 五．实验报告

1. 土壤中细菌菌落数量及特征

菌落特征 菌落 大小 颜色 干湿 边缘 表面 中央 数量 24

1 2 3 4 5 6 7 8 小 小 小 较小 较小 较小 中等 中等 白色 橙色 深黄色 鹅黄 浅灰橙 白色 白色 前灰白 干燥 湿润 湿润 湿润 湿润 干燥 干燥 湿润 边缘干整齐 整齐 整齐 整齐 整齐 整齐 整齐 整齐 光滑 光滑 光滑 光滑 光滑 光滑 光滑 光滑 凸起 凸起 凸起 微凸起 不凸起 不凸起 不凸起 微凸起 1 6 3 1 1 2 3 3 9 中等 浅灰白 燥，中央湿润 褶皱 较光滑 微凹陷 4 10 11 菌种1 菌种2 菌种3 极小 较小 中等 中等 中等 白色 浅灰黄 浅黄色 黄色 白色 湿润 干燥 湿润 湿润 湿润 整齐 整齐 整齐 整齐 整齐 光滑 光滑 光滑 光滑 光滑 微凸起 微凸起 凹陷 凹陷 凹陷 5 2 2 1 1 注：以上数据为土壤悬液稀释1000倍后0.2ml悬液中的菌含量及种类 2.简单染色

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