土壤微生物的分离及鉴定 - 图文(3)

生成量又与反应液中甘露聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。 13.分类鉴定方法

根据菌落形态（包括细菌的运动性），镜检形态（采用显微镜镜检法获取微生物基本信息。如形态、有无芽孢等特征、革兰氏染色结果等）等指标查伯杰氏手册，确定微生物基本范围，暂定菌属。 三．实验材料 1. 土样 7号土样 2.菌种

从土壤中分离得到的产果胶酶的细菌和产几丁质酶的霉菌。 3.培养基

几丁质酶筛选培养基 液体PDA培养基 固体PDA斜面培养基 几丁质酶发酵培养基 果胶酶筛选培养基 液体种子、发酵产酶培养基 固体斜面培养基 固体淀粉培养基

固体油脂培养基 葡萄糖发酵培养基（附德汉式小管） 蛋白胨水培养基 乳糖发酵培养基（附德汉

式小管） 葡萄糖蛋白胨水培养基 牛肉膏蛋白胨半固体培养基 4.溶液和试剂

酵母膏，KH2PO4，K2HPO4，FeSO4 ，MgSO4·H2O， ZnSO4，几丁质，马铃

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薯，蔗糖，琼脂，果胶， MgSO4，葡萄糖，酵母粉，蛋白胨，NaCl，可溶性淀粉，蒸馏水，香油或花生油，1.6%中性红水溶液，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，乳糖，革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液，乙醇，5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液，甘油，甲基红指示剂，乙醚，吲哚试剂，无菌水，刚果红，DNS等。 5.其他器材

平板，试管，玻璃棒，三角瓶，量筒，移液管，移液器，烧杯，载玻片，盖玻片，滴管，漏斗，酒精灯，德汉氏小管，U 型玻棒，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），普通光学显微镜，血球计数板，计数器，接种环，接种针，电子天平，分析天平，试管架，称量纸，标签纸， 吸水纸，擦镜纸，滤纸，加热器，高压蒸汽灭菌锅，恒温箱，，纱布，解剖刀，镊子，载玻片夹子，止水夹，记号笔等。 四．实验步骤 1.土样分离

（1）配制果胶酶筛选培养基250mL,几丁质筛选培养基200mL,0.85％的生理盐水200mL。

（2）取5支试管，每支装入9mL生理盐水，取一只300mL锥形瓶，装入90mL生理盐水，加入少许玻璃珠。将培养基和生理盐水包好、灭菌备用。

（3）将10g土样（7号）溶解到装有90mL0.85％的生理盐水的三角瓶中，摇床30min左右，然后放在30℃恒温培养箱中静置15min。

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2.产果胶酶细菌的筛选及产几丁质酶霉菌的筛选

用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3两种稀释度的土壤溶液（如下图）；

产果胶酶细菌的筛选

（1） 冷却果胶酶筛选培养基——倒平板（6个）。

（2） 选取10-1和10-3两个稀释度，每稀释度3个平板，每平板加液

0.2ml，刮刀涂布，30℃倒置培养 1-2天。 产几丁质酶霉菌的筛选

（1） 冷却几丁质酶筛选培养基,无菌操作加链霉素0.2mL——倒平

板（6个）。

（2） 选取100和10-2两个稀释度，每稀释度3个平板，每平板加液

0.2ml，刮刀涂布，30℃倒置培养3-4天。

3.菌种的分离与纯化（斜面菌种保存）（液体种子）及菌种能力检测 菌种的分离与纯化

（1）培养后，如菌落周围有透明圈，将平板菌落用刚果红染色，具体方法为：用0.5%的刚果红染色15~20分钟后，倒掉刚果红，用1M

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的NaCl脱色几分钟直至观察到透明圈。出现透明圈则说明此菌具有产果胶酶/几丁质酶的能力。 （2）选取此菌进行菌落描述。

（3）用接种环挑取较大透明圈的单菌落至筛选培养基平板，划线分离单菌落。

划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域，然后将接种针在火焰上进行灭菌操作，取含菌种的培养皿，在火焰上方（注意：不能离火焰太近）打开培养皿盖，先拿接种针在上盖处划线以降温，然后用接种针轻挑所选菌落一到两

下，将平皿盖上放好，再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作。操作完毕后对接种针进行灭菌操作，完成后在火焰上方打开平皿盖，将接种针冷却后从1区引线到2区，再如图所示划线，划完后引线到3区，同上进行划线，划线完毕后盖盖平放；

（4）培养后观察是否为纯菌，若菌落形态一致，则挑取单菌落至斜面培养基中培养至长好。若不纯则分别挑取形态不同的菌落分别在筛选平板划线，刚果红确定透明圈，重复挑取和纯化步骤直至得到纯菌落。

（5）将菌种点种在选择培养基上，记录透明圈直径，以区分菌种的能力。

（6）挑取菌种至固体斜面培养基中培养，将斜面置于4℃冰箱保存。

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菌种能力检测

（1）分别配制果胶酶筛选培养基和几丁质酶筛选培养基，110 度灭菌 20-30 分钟，冷却后倒平板。几丁质酶筛选培养基加入配好的链霉素1ml/L培养基后再倒平板。

（2）在培养皿盖周边用记号笔做好标记，将分离纯化的细菌霉菌分别点种于平板上（注意：点种的量不宜过多，以 3～4个为宜），在30℃培养箱中培养 1～2 天（霉菌2～3天），取培养后的果胶酶筛选培养平皿用 0.5％的刚果红染色 15-20min 后，倒掉刚果红，用 1mol/L 的 NaCl 脱色几分钟至观察到透明圈，霉菌直接观察透明圈，测量并记录透明圈的大小。 4.细菌菌落形态观察 5. 细菌的革兰氏染色 （1）制片

取片擦净，并烘干，取活跃生长期细菌按常规方法（酒精灯旁边 接种细菌）涂片（不宜过厚）、干燥和固定。 （2）初染

滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1.5min后倾去染液，水洗至流出水无色。 （3） 媒染

先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗流出水无色。 （4） 脱色

将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管覆盖95% 乙醇脱色30s，然后立即用水洗去乙醇。

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