实验指导(8)

5）静置2 min，吸上清接种至培养瓶中。 6) 补足培养基，37°C培养箱中培养。 7）4 h 后可观察细胞贴壁生长状况。 8）第二天更换培养液。 a．到掉培养基。 b．PBS洗三遍。

c．加入4ml新鲜培养液，37°C培养箱中培养3－7天，细胞互相重叠爬满整个培养瓶底部即可传代。

五、实验结果与分析

大多数细胞贴壁生长后呈梭形

六、思考题：

1.为什么要用发育早期的胚胎？

2.培养的梭形细胞为哪种类型？还有什么类型的细胞存在？

七、注意事项:

1.注意操作过程中保证无菌操作。 2. 绞碎胚胎时尽量绞碎。

附图：小鼠胚胎的分离

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A:打开腹腔； B：取出胚胎；C：去掉胚胎外膜；D：绞碎胚胎

实验十二：细胞的传代培养

一、实验目的

熟练掌握细胞的传代培养法。

二、实验原理

传代培养是组织培养常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。 三、仪器、材料与试剂

材料：培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞。

药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25％胰蛋白酶，Hanks液。

仪器：C02培养箱，倒置：显微镜，超净台。

四、实验方法与步骤

1.人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。

2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。

3．超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭溶液擦净。

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4．打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。

5．点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。

6．将培养用液瓶口用75％酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。

7．倒掉培养细胞的旧培养液。

8．PBS洗3次。培养瓶加入3－5滴胰酶，盖好瓶盖后室温消化。

9．在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶。

9．加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。

五、思考题：

1．细胞传代培养的目的是什么?

2．如何保证在传代过程中不被微生物污染?

3．贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同?

4．如何估计是否传代和传代的方式?

六、注意事项：

1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。

2．经常观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。

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3．如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞。

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