实验指导(6)

(5)3%戊二醛：用磷酸缓冲液配制。

仪器与器材：

显微镜，1.5ml离心管，直头眼科镊子，滴管，载玻片，盖玻片，滤纸，吸水纸。

四、实验步骤：

1.用镊子撕取洋葱鳞叶内侧的表皮若干片（1cm左右)，烟草叶片下表皮若干片，置于1.5ml

离心管中，加入pH6.8磷酸缓冲液1ml，使其下沉。

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2.吸去磷酸缓冲液，加1ml 1％Triton X-100 处理30min。

3.吸去Triton X-100，用M缓冲液洗3 次,每次1ml，3min。

4.用1ml 3％戊二醛固定30min。

5.磷酸缓冲液(pH 6.8)洗3次，每次1ml，3min。

6.用0.5ml 0.2%考马斯亮蓝R250染色15min。

7.蒸馏水洗2次，然后将样品置于载玻片上,加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。

五、结果分析:

描绘所观察到的洋葱鳞叶细胞骨架图。 六、思考题

1.细胞骨架主要有哪几类？主要成分是什么？ 2.为什么用TritonX-100的缓冲液处理材料？

实验九 细胞中DNA、RNA的显示

I. DNA的细胞化学——Feulgen反应

一、实验目的

了解Feulgen反应的原理，掌握有关的操作方法。

二、实验原理

DNA是由许多单核苷酸聚合成的多核苷酸，每个单核苷酸又由磷酸、脱氧核糖和碱基构

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成。DNA经1N盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的双键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反应。Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。

三、实验仪器、材料和试剂 （一） 仪器、用具

显微镜、恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸。 （二） 材料 洋葱鳞茎或根尖 （三）试剂

1.1N 盐酸的配制

取82.5ml比重1.19的浓盐酸加蒸馏水至1000ml。 2.Schiff试剂的配制及保存

称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶），时时振荡，继续煮 5分钟（勿使之沸腾），使之充分溶解。然后冷却至50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml 1N HCl，冷却至25℃时，加入0.5g Na2S2O5（偏重亚硫酸钠或钾），充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24小时（有时需2～3天），使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1分钟，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色也无沉淀，贮于4℃冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之再转变为无色时，仍可再用。 3.亚硫酸水

取200ml自来水，加10ml 10%偏重亚硫酸钠（或偏重亚硫酸钾）水溶液和10ml 1N HCl，三者于使用前混匀。

四、方法与步骤

1.将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1N HCl中，加热到60℃水解8～10 min。 2.蒸馏水水洗。

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3.Schiff试剂遮光染色30min。

4.用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次1min。 5.水洗5min。

6.将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱表皮可省去压片这一步）。 7.显微镜检查。

结果：细胞中凡有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应。 对照片：

方法一，先将材料放在5%三氯醋酸中90℃水浴15min，主要把DNA抽提掉，然后按步骤1—7制片观察。

方法二，材料不经1N HCl水解，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤4—7制片观察。

五、作业

1.简述Feulgen反应的原理和实验的关键步骤。 2.绘图示洋葱根尖细胞或鳞茎表皮细胞DNA的分布部位。

II. RNA的细胞化学——Brachet反应

一、实验目的

了解Brachet反应的原理，掌握有关的操作方法。

二、实验原理

甲基绿—派洛宁（Methyl green-Pyronin）为碱性染料，它能分别与细胞内的DNA、RNA结合而呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿和染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择结合显示红色。其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色，但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色。即RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成蓝绿色。

三、实验仪器、材料和试剂 （一）器材

显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸

（二）材料

洋葱鳞茎表皮

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（三）试剂

1．Unna试剂：甲基绿—派洛宁（Methyl green-Pyronin）染色液 甲液： 5%派洛宁水溶液 6ml 2%甲基绿水溶液 6ml 蒸馏水 16ml

乙液： 1M醋酸缓冲液（pH=4.8） 16ml

甲、乙两液分别置4℃冰箱备用，用时甲乙两液混匀。 2．1M醋酸缓冲液（pH=4.8）配方 A液： 冰醋酸6ml加蒸馏水至100ml 。 B液： 醋酸钠13.5g加蒸馏水100ml 。 取A液40ml+ B液60ml 混匀即为pH=4.8 。

配制注意事项： （1）Pyronin可加热助溶。

（2）Methyl green批号不同，染色效果差别很大。商品Methyl green常混有甲基紫， 影响染色效果，应先把药品放在分液漏斗中，加入足量的氯仿，用力振荡，然后静置，直到洗脱甲基紫为止，最后干燥备用。

四、方法与步骤

1.用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块，置于载玻片上。 2.滴一滴Unna试剂，染色30min。

3.蒸馏水洗两次，吸水纸吸去多余的水分。 4.盖上盖玻片，镜检。 对照片：

（1）撕取洋葱鳞茎内表皮，经5%三氯醋酸中90℃水浴处理15min 。再经70%乙醇洗片刻，然后按步骤1-4制片观察。

（2）撕取洋葱鳞茎内表皮，用0.1%RNA酶室温处理10～15min 。蒸馏水洗，吸干，然后按步骤1-4制片观察。

五、思考题

1.简述Brachet反应的原理。 2.绘图示细胞中RNA和DNA的分布。

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实验十：细胞培养的准备工作

一、实验目的

了解细胞培养常用实验仪器的使用方法，掌握细胞培养常用物品的洗消方法和无菌操作的要领。

二、实验原理

细胞培养是从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。细胞培养需要的基本条件包括：1、合适的细胞培养基：合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。2、优质血清：目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。3、无菌无毒细胞培养环境：无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。4、恒定的细胞生长温度：维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。5、合适的气体环境：气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。

三、常用培养器皿及清洗

细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，因此掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作必须的。 一、清洗：离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。

（一）玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗4个步骤。

1.浸泡:新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5％盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。

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