实验指导(3)

8.电镜使用完毕后，先关掉机器，再关冷却水和总电源。 （二）超薄切片的观察

在教师的指导下，将超薄切片样品至于透射电子显微镜下，认真仔细观察细胞的超微结构，选择满意的区域，进行拍照。

六、注意事项

1.取材时动作一定要迅速，所用刀片要洁净锋利，否则会损伤样品结构。

2.配置包埋剂的过程中，需要充分搅拌，在搅拌的同时，防止包埋剂产生很多小气泡，如产生需要将包埋剂放入40℃烘箱中，赶走小气泡。否则样品不能充分浸透。包埋过程中所使用的一切器皿和工具，都必须充分干燥。

3.锇酸即四氧化锇挥发性强，属强氧化剂，毒性强，因此使用时注意通风，操作时应在通风橱中进行。配置和储存不当会产生锇黑，使其失效，因此需冷冻、密封和遮光保存，临用前需彻底化开，以免浓度欠佳。

4.醋酸铀染液有微量放射性，能发荧光，需小心使用、避光保存。

七、思考题

1.简述透射电镜超薄切片制备的生物样品取材过程中有那些要求，为什么? 2.简述超薄切片制备技术中用戊二醛、锇酸进行双固定的意义。

II. 扫描电子显微镜的使用

一、实验目的

1. 了解解扫描电子显微镜样品制备过程。 2. 了解扫描电子显微镜的使用技术。

二、实验原理

扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）的分辨本领虽然不如透射电镜（TEM），但却具有很强的立体感，可以在亚细胞水平上生动地显现生物样品的三维结构，适合于观察样品的表面形貌，在生物学上，通常于观察研究组织和细胞表面的三维立体显微及亚显微结构。扫描电镜与透射电镜相同的是都采用电子束作光源，电磁场作透镜。所不同的主要是电子束、电子束照射样品的方式和被利用来成像的信号电子不同。扫描电镜主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射。二次电子能够产生样

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品表面放大的形貌像。这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，即是使用逐点成像的方法获得放大像。

由于观察目的不同，除了使用相同的固定液之外，SEM生物样品制备与TEM有较大的差异。为了得到无损、真实而清晰的表面形貌结构，在SEM样品制备的全过程中都必须十分小心地保护被观察面。在取材时，针对不同的样品、不同的观察要求，采取不同的技术，使被观察表面充分地暴露出来；脱水时，为了避免观察表面皱缩变形，设计了特殊的干燥方法；此外，还必须对样品进行导电处理，在样品表面喷镀一层厚度适当、均匀的金属膜。

三、实验材料、试剂和仪器

（一）仪器、用具

扫描电子显微镜、临界点干燥器、离子溅射仪、超声波清洗机、电吹风机、磁力搅拌器、干燥器、抛光膏、刀片、剪刀、镊子、样品盒、酒精灯、牙签、竹签、培养皿、烧杯、量筒、量杯、注射器、载玻片、脱脂棉、导电胶。

（二）材料 小鼠小肠 （三）试剂

2.5％戊二醛溶液、1％锇酸溶液、0.2mol／L磷酸盐缓冲溶液，醋酸异戊酯、液体二氧化碳、双蒸水。

四、方法与步骤

1. 准备样品托

用抛光膏擦净样品托，然后用丙酮洗净抛光膏，电吹风吹干备用。 2. 取材

注意保护好被观察表面，彻底清洗干净，暴露出最佳位置。样品体积应依据观察要求及样品托大小等酌情而定。

3. 固定、漂洗和脱水

由于扫描电镜是观察样品某一表面形貌的，所以固定时间可以比透射电镜短。另外，脱水时，到纯乙醇级即可。漂洗可参考透射电镜样品制备。

4. 用醋酸异戊酯置换乙醇

弃去乙醇，用醋酸异戊酯与纯乙醇l:1的混合液浸10～20min。弃去混合液浸入纯醋酸异戊酯，浸10～20min。

5. 二氧化碳置换醋酸异戊酯及临界点干燥

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从纯醋酸异戊酯中取出样品，保持湿状态时置入临界点干燥仪（critical point dryer）的样品盒并放进样品室（预冷）。盖紧样品室，充入液体二氧化碳，液面高出盒面。缓慢排出气体二氧化碳。直至样品保持湿润、周围有少量液体二氧化碳为止。重复充液排气2～3次。然后，向样品盒内注入液体二氧化碳（高度不超过80％），加热、加压达到临界点进行干燥之后，排气。取出样品放入干燥器内备用。临界点干燥是利用液态二氧化碳的临界状态下表面张力为零的特性，使样品中的液态二氧化碳逸出，避免了表面张力对结构的破坏。

6. 粘贴样品

用少量导电胶涂在样品托上，用镊子轻夹样品侧面，观察面朝上置于样品托上。 7. 离子溅射镀膜

把样品托插入离子溅射仪真空室样品台上，操作溅射仪，可使样品表面覆盖一层10～15nm厚的金属膜。溅射镀膜的基本原理是：高能粒子轰击金属靶（金、铂、钯铱合金等），靶金属原子获能后由靶表面逸出而沉积在样品表面，形成连续的导电膜。这种金属膜不仅可以导电，受激产生较强的二次电子发射，严格地控制膜的厚度，是获得清晰、真实的二次电子表面形貌成像效果的重要条件。

五、实验结果及分析

（一）扫描电镜的操作 扫描电镜的一般操作步骤如下：

1.启动电镜。包括接通电源，开动真空系统进行排气，在真空度达到要求后，接通显示单元电源。

2.放入样品，注意调节样品高度。

3.设定观察条件。这些条件包括：加速电压、束电流、光栏直径、工作距离、放大倍率以及倾斜角等。注意选择好视野。 4.聚焦，消像散。

5.照相摄影。根据底片特性选择合适的反差、亮度及拍摄时间。 6. 电镜使用完毕后，先关掉机器，再关掉电源和冷却水。 （二）样品标本的观察

在教师的指导下，将样品标本至于扫描电子显微镜下，认真仔细观察标本的表面形貌特征，进行拍照。

六、注意事项

1.戊二醛用时现配，常与锇酸配合使用，其缺点是不能增加样品的二次电子发射率。

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2.四氧化锇属重金属盐类，具有增加反差作用，因而可提高样品的二次电子发射率，缺点是易氧化。

3.进行扫描电镜标本制备时，不同的样品制样方法有所不同，但都应遵循以下原则：①在样品制备过程中，防止标本污染和损伤，尽可能地保持原有结构；②在脱水和干燥处理时，尽量减少因标本收缩导致的人为假象；③在应用组织导电法处理样品时，应充分漂洗，以防镜筒污染。

七、思考题

1.分析扫描电镜与透射电镜的主要异同点。 2.简述扫描电子显微镜生物样品制备的过程。

实验三、细胞膜的渗透性

一 、实验目的：

了解细胞膜的渗透性及各种物质进入细胞的速度。

二、实验原理

人工合成的脂质体主要用来研究细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。但不同分子通过脂双层扩散的速率差别很大，主要取决于它们在脂类和水之间的分配系数及其分子的大小。分子越小，分配系数越大，通过质膜的速率越快。小的、亲脂性的、非极性分子容易溶解于脂双层，可迅速透过脂双层。小的、不带电荷的极性分子如果时间足够，也能很快透过脂双层；大的、不带电荷的极性分子可以跨膜扩散运输，但比较困难；对于带电荷的分子或离子，由于这些分子的电荷及高的水化度，因此不管多小，都很难透过脂双层的疏水区，它们要通过载体介导的主动运输方式跨膜运输。

与人工脂双层膜不同的是，生物膜不但允许水和非极性分子借简单的物理扩散作用透过，还允许各种极性分子，如离子、糖、氨基酸、核苷酸及很多细胞代谢产物通过特有的机制通过。

如果将红细胞放置在各种溶液中， 根据红细胞质膜对各种溶质的渗透性不同，有的溶质可渗入，有的溶质不能渗入。即使能渗入，速度也有差异。可通过观察红细胞溶血现象时间的不同来记录渗入速度。血红蛋白从红细胞中逸出的现象称为溶血现象。渗入红细胞的溶质能提高红细胞渗透压，使水进入红细胞，引起溶血及细胞膜破裂。此时光线较容易通过溶液，使溶液呈现透明即为溶血。由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同。因此，可通过溶血现象来测量各种物质通透性的差别。

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三、材料、试剂和仪器

1．材料 一龄鸡，将鸡血溶于含有抗凝剂的等渗液中（肝素钠0.2mg/mL,一般范围在 0.01-0.2mg/mL；等渗液为0.15mol/L NaCl）

2. 试剂 0.17 mol／L氯化钠，0.17 mol／L 氯化铵，0.17 mol／L硝酸钠， 0.32 mol／L葡萄糖，0.32 mol／L甘油，0.32 mol／L乙醇，0.32mol／L丙醇；0.12 mol／L硫酸 钠，0.10 mol／L草酸钠，0.10mol／L醋酸钠，

3. 器材 试管，5mL量筒，滴管，载玻片，盖玻片，光学显微镜。

四、实验程序

1．血红细胞悬液：用注射器吸入 2mL含有肝素的等渗液后从鸡翼下静脉取鸡血5mL，加 入50mL烧杯，将鸡血用等渗液进行1：10稀释。

2． 溶血现象观察：取试管一支加入3mL蒸馏水， 加入1滴或2滴稀释的鸡血，轻混一下，

然后静止注意观察溶液的颜色变化。由于红细胞发生破裂，溶液颜色由浑浊的红色逐渐清亮。此即为溶血现象。

3． 鸡红细胞的渗透性记时比较：

对上述溶液进行溶血记时比较，注意从滴进血红细胞开始记时，操作方法同2。 注意观察颜色变化，回答是否有溶血现象？ 为什么？

五、结果与分析

将观察到的现象记录， 并进行分析

试管编号 溶液种类

1 2 3 4 5 6 7 8

是否溶血 溶血所需时间

结果分析

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