分子诊断学复习资料__简答题部分(5)

56、试述生物芯片的种类及主要功能。

生物芯片根据其结构特点，可以将生物芯片分为微阵列芯片和微流体芯片两个主要类别。微阵列芯片是由生物材料微阵列构成的芯片，包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等，由于它们的工作原理都是基于生物分子之间的亲和结合作用，如核酸分子的碱基配对作用，抗原和抗体的结合等，所以通常也称为亲和生物芯片。微流芯片是以各种微结构为基础的芯片，利用它可实现对各种生化组分的微流控操作和分析，这类芯片的代表有毛细管电泳芯片、PCR反应芯片、介电电泳芯片等。(生物芯片发展的最终目标是将各种生物化学分析操作的整个过程，从样品制备、生化反应到结果检测，都集成化并缩微到芯片上自动完成，以获得所谓的微型全分析系统（micro total analysis systen,μ-TAS）,或称“微缩芯片实验室”（lab-on-a-chip）。微缩芯片实验室代表了生物芯片技术发展的未来。) 57、核酸探针：序列已知的、能与待测的靶核酸序列互补结合、并带有可检测标记的核酸片段。（它可以是整个基因，或基因的一部分；它可以是DNA或RNA）。

58、基因组DNA探针：为某一基因的全部或部分序列。 缺点：真核基因组含有内含子序列；因此，当其用于检测基因表达时，杂交效率低

cDNA探针：从已构建的cDNA文库中筛选和分离出来的靶基因序列。cDNA探针无内含子序列，尤其适用于基因表达的检测，目前应用最广。

59、基因组探针和cDNA探针的共同优点：①制备方便：克隆于质粒载体中②稳定：DNA探针较RNA探针稳定；RNA易被RNA酶降解③标记方法成熟和多样。共同缺点：双链探针存在自身复性，影响杂交效率。

60、RNA探针的优点：单链：杂交时不存在第二条链的竞争（自身复性），杂交效率高；含RNA的杂交体更稳定（Tm更高），杂交反应可以在更为严格的条件下进行，因而RNA探针杂交的特异性高 主要缺点：探针不稳定，易被RNase降解。RNA探针适合于：Northern杂交、原位杂交等。 61原位杂交的基本原理

样本经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与组织、细胞中待检测的核酸进行特异性结合形成杂交体，然后通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下对待测核酸进行细胞内定位的方法。

62、核酸杂交技术是一种分子生物学的标准技术，用于检测DNA或RNA分子的特定序列（靶序列）。DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼农膜上，与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性标记。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。

63、核酸分离与纯化的原则：

1.保证核酸序列结构完整性，防止降解和结构破坏; 2.剔除其他物质，保证纯度

64、在核酸的分离和纯化过程中，如何保持核酸的完整性？

[本题答案] 为了保证核酸的完整性，首先在操作过程中，应尽量简化操作步骤，减少各种破坏核酸的有害因素，包括物理、化学与生物学的因素。提取应在0～4℃的条件下进行；另外避免强力的机械剪切力对核酸的破坏。细胞内或外来的核酸酶对核酸的生物降解，而破坏核酸的一级结构，使用EDTA、柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性；并尽可能地抑制RNA酶的活性。 65、RNA的分离与提取：

难点：RNA在体外十分不稳定，易降解，不易得到全长；RNA酶在体外存在于手汉、唾液、呼吸、灰尘中。 原则：防止污染、防止降解。

防止方法： 高压灭菌；器皿：200 ℃烘烤2h；试剂：采用焦碳酸二乙脂（DEPC）处理；戴手套、口罩。

提取方法：（1）异硫酸胍-酚氯仿法： 异硫酸胍（4M）+巯基乙醇（0.14M）为蛋白质变性剂，酚/氯仿抽提，异丙醇沉淀RNA，75%乙醇洗涤（2）TRIzol法： TRIzol （苯酚+硫氰酸化合物）+氯仿+异丙醇+75%乙醇（3）酚-氯法。

纯化方法：饱和酚（pH4.5-5.5） 66、简述原位杂交在临床中的应用

原位杂交技术可以通过标记的探针与分裂中期染色体DNA杂交来精确定位特定核苷酸序列在染色体上的位置；与细胞RNA杂交可观察组织细胞中特定基因的表达水平；还可用特异性的细菌或病毒的核酸序列作为探针与组织、细胞杂交，以确定有无病原体的感染等。原位杂交能在成分复杂的组织中对单一细胞进行研究，不受同一组织中其它

成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其它组织中的细胞内DNA或RNA的研究更为方便。此外，原位杂交不需要从组织中提取核酸，有利于检测组织中含量极低的靶序列，并可完整地保持组织和细胞的形态，更能准确地反应出组织细胞的相互关系及功能状态。举例：原位杂交检测上皮细胞中人乳头状瘤病毒（HPV）DNA。 67、简述临床诊断常用的FISH探针的类型及用途。

根据核酸探针的序列特点，可将FISH探针分为三大类：重复序列探针、单一序列探针和全染色体涂抹探针。重复序列探针（repetitive sequences probes）是指与某条特定的染色体结构结合、特异识别重复DNA序列的探针如着丝粒探针、端粒探针等。一般来说，不同的染色体，着丝粒重复序列中的核苷酸序列也不同，但端粒重复序列不具有染色体特异性。单一序列探针(Unique sequence probes)与某条染色体上特定的区域或基因的单拷贝DNA序列杂交。包括带特异性探针（band special probes）和基因座特异性探针（Locus Specific probes）等。全染色体涂抹探针（whole chromosome painting probes, WCP）是识别一条特定染色体全长上的单一序列探针的混合物。 68、临床基因扩增检验实验室应如何设置。

由于基因扩增检验是对靶核酸的指数倍扩增过程，因而有大量的扩增产物的出现，这种扩增产物极易对以后的新扩增反应产生“污染”，为防止这种污染的发生，就需要对基因扩增检验实验室进行严格的分区。临床基因扩增检验实验室原则上分为四个分隔开的工作区域，即试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区以及扩增产物分析区。如果采用全自动扩增仪，后两个区域可以合并。应注意的是，各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。进入各工作区域必须严格按单一方向进行，即试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。各区的仪器设备包括工作服、鞋子、实验记录本和笔等都必须专用，不得混淆。此外，上述四个工作区域内还应有固定于房顶的紫外灯，以便于工作后区域内的空气照射。 69、如何保证临床基因扩增检验实验室的质量。

临床基因扩增检验实验室的常规测定由一系列步骤组成，包括样本收集、样本处理（核酸提取）、核酸扩增、产物检测结果报告及解释等。室内质量控制仅涉及样本处理、核酸扩增和产物分析等测定分析步骤，而室间质量评价则

除了监测测定分析步骤外，还包括较大范围的实验室活动，诸如样本接收中的可靠性、结果报告及解释等。QA则是覆盖更广范围的活动，包括样本收集、结果报告和解释等。

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