分子诊断学复习资料__简答题部分(4)

PCR反应体系包含DNA模板、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、dNTP及含有必需离子的反应缓冲液，这些因素都对PCR反应产生影响。

41、影响PCR反应的因素有哪些？

PCR反应体系包含DNA模板、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、dNTP及含有必需离子的反应缓冲液，这些因素都对PCR反应产生影响。

42、简述bDNA信号放大系统的原理。

分枝DNA是人工合成的带有侧链的DNA片段，在每个侧链上都可以标记可被激发的标记物。以bDNA为基础建立的连续放大DNA信号以检测DNA的技术称为分枝DNA信号放大系统。

bDNA信号放大系统包括四种杂交探针，即目标探针、前放大体、 放大体和标记探针。首先用亲和素包被微孔，加入目标探针，该组探针能与等检核酸靶序列上不同区域互补，其5′端用生物素标记，能与微孔中的亲和素高度亲和结合；再向微孔中加入待测标本，目标核酸与固定于微孔中的目标探针结合；再加入前放大体，该组探针的一段能与目标核酸的不同区域互补结合，另一段与放大体（即分枝DNA）的主链部分的序列互补结合，分枝DNA由主链和数十根寡核苷酸组成，每个分枝上都有标记探针的杂交位点，由酶标寡核苷酸组成的标记探针与bDNA上的互补序列结合，加入底物后最后经化学发光检测仪检测。利用bDNA信号放大系统可在每个靶序列上结合60～300个酶分子，而且所有杂交反应同时进行，观察到的信号与靶DNA的量成正比，可通过标准曲线将靶DNA定量。 43、简述链末端终止法测定 DNA 序列的原理

答：利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作为链延伸终止剂，在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。

44、简述化学法测定 DNA序列的基本原理

答：化学法是对待测DNA进行化学降解。在化学法的测序系统中，先对待测DNA末端进行放射性标记，然后分成4组或5组互为独立的化学反应体系，每一组用不同的化学试剂特异地针对某一种或某一类碱基进行化学切割，通过化学降解后产生长短不一的DNA片段，其长度取决于改组反应所针对的碱基在待测DNA片断中的位置，将各组反应产物通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后直接识读待测DNA的序列。 45、Sanger双脱氧链终止法,全称：双脱氧链末端合成终止法

原理：利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立4种互相独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷酸三磷酸（ddNTP）作为链延终止剂，在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5’到3’方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。每个测序反应体系的组成：1.DNA聚合酶；2.单链DNA模板（待测片段）；3.带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物；4.Mg2+；5.原料-dNTPs(dATP,dGTP,dCTP和dTTP)；6.终止剂-ddNTPs(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)

测序体系的关键成分：（1）链终止剂，2’，3’-二脱氧核糖核苷酸（ddNTPs)（2）用于测序的变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE) 胶长40cm，厚度均匀；4-8%丙烯酰胺；7mol/L尿素 （3）模板，即待测序的DNA片段（4）引物。酶促测序反应中，利用一个与模板特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA合成的引物（5）DNA聚合酶（6）放射性同位素标记的dNTP：α-35S-dNTP

焦磷酸测序技术（PSQ)：在以靶DNA链为模板指导核酸合成的过程中，将释放的可见光作为检测信号，从而对靶DNA链进行实时测序的方法，是一种合成测序技术。原理：同一反应体系中由四种酶催化的级联化学发光反应，首先让测序引物与待测模板结合成杂交体，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中，并释放出等摩尔的焦磷酸基团（PPi），PPi最终转化为可检测的光信号，并由Pyrogram TM 转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比，随后，加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。产生的荧光信号自动传入分析系统，直接测读靶DNA序列。特点：1.无需电泳，也无需荧光标记，操作极为简便，具快速、准确、经济和实时；2.阅读能力已从100bp至400bp ；3.该技术具有多种不同的用途。

46、简述哺乳动物细胞基因组DNA抽提的主要方法有哪几种？

哺乳动物细胞基因组DNA抽提的主要方法有： 酚提取法、甲酰胺解聚法 、玻棒缠绕法和异丙醇沉淀法、磁珠吸附法等。

47、简述重组DNA技术的原理及技术。

重组DNA是在体外利用限制性内切酶，将不同来源的DNA分子进行特异的切割，获得的目的基因或DNA片段与载体连接，从而组成一个新的DNA分子。重组的DNA分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，并在宿主细胞中进行无性繁殖，获得大量的目的基因或DNA片段。经重组的DNA分子能在宿主细胞中进行表达，获得相应的蛋白质。

大致步骤包括：①目的基因的获取；②载体的选择；③目的基因与运载体连接成重组 DNA；④重组DNA导入受种细胞；⑤重组体的筛选

49、简述黏性末端DNA重组体的构建过程。

目的基因和载体可由同一种限制酶切割后产生，或由不同的限制酶切割形成互补黏性末端，经退火，彼此间很容易按碱基配对原则形成氢键。然后由DNA连接酶催化连接接头处的缺口，形成重组质粒。载体DNA在限制酶切割后，用碱性磷酸酶处理，除去5’端磷酸基，以避免载体DNA自身环化。 50、举例说出重组DNA技术在医药领域的应用。

可以利用重组DNA技术探明致病基因的结构和功能，了解其致病机制；开发基因工程药物和疫苗用于临床；建立基因诊断、治疗技术，为疾病的预防、治疗提供新方法、新技术。具体可用于基因诊断：基因诊断是从基因水平上检测人类遗传性疾病的基因缺陷；基因治疗：是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过载体导入人体靶细胞取代靶细胞中的缺陷基因，从而达到治疗疾病目的的方法；基因工程药物、疫苗和抗体的研究和制备；利用基因敲除或转基因技术可改造生物、培育新的生物品种或用于药物筛选和新药评价等。

51、基因芯片的主要类型及其特点（1）从支持物来分 ①薄膜型：聚丙烯膜、硝酸纤维素膜和尼龙膜②玻片型：生产此类产品的公司 如 Affimetrix （2）从点阵的制备方法来分 ①原位合成型（In Situ Synthesis） ②合成点样型

（off-chip synthesis） （3）根据探针片段长度分 ①Oligo-Chip：约8~25nt，常用于基因类型的分析，如突变、正常变异（多态性）和测序②cDNA-Chip：<2000nt，常用于基因表达和差异表达分析（两种或以上相关样本）③Genomic Chip：>5000nt，基因组结构分析（4）根据用途分：基因变异检测芯片表达谱芯片功能基因芯片. 52、生物芯片：采用平面微细加工技术（光导原位合成或微量点样等）将大量生物样品（核酸、多肽、细胞、组织切片等）有序地固化于支持物表面（玻片、硅片、尼龙膜等）由此组成的密集二维生物样品的微阵列。 原理：分子间特异的相互作用

生物芯片技术的特点：1）高度交叉的综合性新技术；2）高度集成性、微型化和连续化；3）高通量；4）通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法，可使该技术具有多种不同的应用价值。 基因芯片：

1）基因芯片：有序地、高密度地排列着大量的基因片段（probe)的载体(玻璃片或纤维膜等)。2）基因芯片技术：将大量核酸探针分子固定于支持物上，标记的样品分子按碱基互补原则与探针进行杂交，通过检测杂交信号分布和强度、进而获取关于样品分子的序列和数量的信息，是高通量研究基因表达、突变等的革命性技术。 基因芯片检测的原理和步骤：

原理：将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的待测样品进行杂交，通过检测杂交信号的分布和强度，实现对样品中基因信息的定性和定量分析。 基本步骤：

1.芯片制备。2.靶核酸制备（样品提取纯化、扩增和标记）3.靶核酸与探针（芯片）杂交 4.杂交结果的扫描5.图像分析和数据处理 基因芯片的特点：

1.微型化和自动化；现有芯片面积：最大525cm２,最小1cm２样品DNA的用量：5nl/阵点 杂交和洗片等过程自动化,工作效率极高。

2.高度平行性；实验组和对照组的样品等都在同一张芯片上同时进行杂交分析,结果的可比性好。

3.巨大的信息产出率；芯片上各点所对应的基因或其表达的定性（量）分析、差异表达分析等。 4.高度敏感性和专一性；能可靠并准确检测出10pgDNA/μL样品。 5.可反复使用；一张由尼龙膜制作的微阵列，可以重复杂交使用多达20次。 53、简述蛋白芯片的原理及应用。

蛋白质芯片的基本原理是采用原位合成、机械点样或共价结合的等方法将多肽、蛋白、酶、抗原、抗体固定于固相介质上形成的生物分子点阵，在待分析样品中的生物分子与蛋白质芯片的探针分子发生杂交或相互作用或其他分离方式分离后，利用激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行高通量检测和分析。蛋白质芯片是将整个蛋白质水平的相关生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对多肽、蛋白质及其他生物成份进行高通量检测。

蛋白质芯片技术是一种快捷、高效、高通量、并行、微型化和自动化的蛋白质分析技术，适用于分析包括组织、细胞系、体液在内的多种生物样品能分析包含针对信号传导、癌症、细胞周期调控、细胞结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能的相关蛋白，灵敏度高达pg/ml。 54、举例说明基因芯片在临床诊断中的应用。

基因芯片作为一项现代化的诊断新技术在感染性疾病、遗传性疾病的诊断和耐药性检测等方面已显示出良好的应用前景。下面举例说明基因芯片在疾病诊断的应用。

（1）感染性疾病的诊断。性传播疾病、肝炎等。

（2）遗传性疾病的诊断。地中海贫血、血友病、婚前检查等。 （3）耐药性检测。结核分支杆菌耐药性检测芯片等。 55、试述基因芯片的工作原理及制备。

基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效、快速的核酸序列分析手段。它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。在一块1cm2大小的基因芯片上，根据需要可固定数以千计甚至万计的基因，以此形成一个密集的基因方阵，实现对千万个基因的同步检测。基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析。

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