分子诊断学复习资料__简答题部分

简答

0、基因组的特点：（大题） 人类基因组的特点：

1、人类基因组具有23对染色体，基因组序列大约2.9亿个核苷酸，含有蛋白质编码基因大约20, 000-25, 000个。其中大量基因与中枢神经系统，特别是脑部发育相关；

2、绝大多数基因为断裂基因，且分布不均（每条染色体具有基因富集区和基因稀疏区）。除蛋白质编码基因外，其他大量基因为RNA编码基因；

3、基因内和基因附近中存在大量短序列调控元件，发挥基因的调控表达和协调表达的作用；

4、基因组（基因内）中存在大量功能未知的其他序列（“非编码DNA”），如串联重复序列、转座元件。 5、序列突变是人类基因突变的重要来源，序列/基因多态性是研究人类遗传突变的重要手段。 6、线粒体DNA（mtDNA）是人类母系遗传疾病的重要来源基础。 真核基因组特点：

1. 真核基因组结构庞大：人：3×10^9bp。几、十、百倍于原核。

2.线性双链DNA，多条染色体和二倍体（Diploid）：DNA和组蛋白质形成染色体，存在于核膜内。人：23对，46条；

3.单顺反子(Monocistron) ：一个结构基因转录生成一条mRNA。

4. 功能基因不连续性，内含子与外显子并存（断裂基因）：转录后需剪接(Splicing) 5. 非编码区多于编码序列(9:1)

6.含有大量重复序列（Repetitive Sequences): 重复次数可达数百万次，序列多态性是真核生物基因组的重要特征。 原核生物基因组的特点：

1. 基因组呈共价闭合环状双链状态，散布在细胞中，有时相对集中形成类核/拟核（Nucleoid）

2. 基因组DNA小，基因数目少（1500-5900个），种间DNA大小差异大，GC含量差异大(菌种鉴定和分类标

准），基因多为单拷贝基因（编码rRNA 、tRNA基因多拷贝，利于核糖体的快速组装和蛋白质合成） 3. 基因组只有一个复制起始点，功能相关的基因大多成簇地串联排列（操纵子结构）在染色体上，结构基因无内含

子，基因连续分布，为多顺反子。

4. 除主基因组外，原核生物往往还具有质粒基因组

5. 转座元件/基因是原核生物基因组的重要特征（转座元件（Tranposable Element）是指可移动的基因成分，即

能在一段DNA分子内部或两段DNA分子之间移动的DNA片段，又称跳跃基因。） 6. 致病基因是致病原核生物基因的重要特征 病毒基因组的特点：

1. 基因组大小相差很大（HBV：3.2kb，痘病毒：300kb）

2. 结构分子具有多样性（DNA病毒/RNA病毒，单链DNA/RNA病毒，双链DNA/RNA病毒，环状分子/线性分子） 3. 基因组多数是连续性（单一分子基因组），但RNA病毒往往不连续 （呼肠孤病毒：10条节段双链RNA，甲乙

流感病毒：8条单链节段RNA，丙型流感病毒：7段单链节段RNA 。包装在同一个病毒颗粒内，或在不同病毒颗粒内，只有全部基因组序列都存在，才具备感染能力） 4. 编码序列占基因组的90%以上，间隔区序列很少；

5. 多为单拷贝（单倍体），即每个基因只出现一次（除逆转录病毒基因组有两个拷贝）； 6. 相关基因丛集（功能上相关的基因排列在一起）、有重叠基因和不规则基因结构序列。 1、试述点突变（基因背景清楚和未知）的主要检测方法。

答：对基因背景清楚或部分清楚的点突变，可以采取直接检测基因点突变的方法，如等位基因特异性寡核苷酸杂交(allele specific oligonucleotide，ASO)、PCR-ELISA、等位基因特异性扩增(allele specific amplification，ASA)、PCR-RFLP、基因芯片技术等进行诊断，例如β地中海贫血，可以使用ASO、PCR-RFLP 联合基因芯片技术进行诊断。对于一些基因背景未知的点突变，可以采用单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism，SSCP)、变性梯度凝胶电泳(denaturing graient gel electrophoresis，DEEG)、异源双链分析(heteroduplex analysis，HA)、DNA序列测定、蛋白截短测试（protein truncation test，PTT）等方法，如Hopkins大学医学院的研究人员设计了47 对PCR引物，分段扩增血友病A因子Ⅷ 基因片段，进行DGGE分析，发现多态性片段后再进行DNA序列分析，几乎查清了所有临床轻中度病人的点突变。

2、试述限制性内切酶MstⅡ切割法诊断镰状细胞贫血的原理并图示。 答：

3、试述近端重组、远端重组概念。

答：在FⅧ基因区域内，有一种A基因存在三个拷贝，其功能不详，其中一个A基因位于FⅧ基因的第22 号内含子内(A1)，另外两个位于X染色体的末端(A2、A3)。A1基因可以与其上游的两个A基因拷贝中的一个发生同源重组，引起FⅧ基因的1-22 外显子片段倒位，这种倒位导致FⅧ功能完全丧失而发生严重的血友病(图15-5)。其中与A2发生的重组称为近端重组，约占倒位的15％；与A3发生的重组称为远端重组，约占倒位的85％。 4、简述TGGE/DGGE的基本原理

答：在TGGE中，随着温度的逐渐升高时，DNA分子会呈阶梯式逐步发生解链。部分解链的双链DNA分子表现出一种复杂的分枝构像，使得其电泳迁移率大大下降。DNA分子的解链决定于该分子的解链温度（Tm），而Tm有强烈的序列依赖性，如在单取代突变中，若是A:T（两个氢键）被G:C（三个氢键）取代，将增加该双链DNA分子的Tm值。而整个DNA分子序列对解链温度也有影响，若A:T被T:A替代，或G:C被C:G替代，分子的解链温度也会发生改变。因此不同的DNA分子由于其Tm不同，将于不同凝胶位置（温度不同）产生分枝（解离）使电泳迁移率降低，从而在凝胶上的不同位置形成条带。DGGE的变性条件为热（一般为60℃的恒定温度）和固定比率的甲

酰胺（0－40％）、尿素（0－7M）。这些梯度变性的功能就相当于TGGE中的温度梯度的功能，使不同DNA分子在不同的凝胶部位发生解链，引起迁移率下降，从而将不同的DNA分子分离。 5、简述变性高效液相色谱法检测基因变异的优点

答：DHPLC突变检测技术与其它方法相比，具有更高的准确性和敏感性。

（1）DHPLC与各种电泳法的比较 SSCP 分析片段长度<300 bp，对于人类SNP的检出率为50～95％，尤其容易漏检位于发夹结构中的变异。CSGE检测杂合子的灵敏度与SSCP相当或稍低。而DHPLC对150bp~600bp的DNA片段的突变检出率都可达到100％，且而不需要特殊的样本处理。TGGE/DGGE对于异源双链及同源双链分子的检测灵敏度高出CSGE和SSCP很多。但对于较高温度的融解区域的突变检测，DHPLC的灵敏度要高于TGGE/DGGE。（2）DHPLC与DNA测序的比较 对于频率高于20%的变异，直接测序的检出率为80％，DHPLC的检出率可达到100％；基因突变频率低于20%时就很难用测序方法检测到，而DHPLC可从待检样品中检测到占总基因量0.5-5%的突变等位基因，且重现性很好。 6、试述PTT检测基因变异的优缺点

答：PTT检测突变的优点：①能检测出只与疾病相关的蛋白截短突变；②可检测出在RNA形成过程中发生的突变（如剪接突变）；③通过只鉴定引起疾病截短突变，PTT分析不会受到基因沉默变异如多态性的妨碍；④截短蛋白分子的长度指明了突变的位置，因此更方便进行测序分析以确定突变。

PPT检测突变的缺点：①由于PCR扩增效率的影响，对于包含几千个核苷酸序列多个外显子的疾病基因，就需要分成几个1－2kb的片段分别扩增，分别进行PTT检测；②由于微小缺失/插入突变对蛋白产物分子大小影响太小，凝胶不能分辩，因而检测不出编码序列中小的插入或缺失或是错义突变；③引起RNA产量改变或使mRNA不稳定的突变可能被漏检。 7、简述PFGE的基本原理

答：PFGE采用一种正交的交变脉冲电场，在进行琼脂糖凝胶电泳时，其方向、脉冲时间和电压大小可交替改变。在每次电场方向改变时，DNA分子就要有一定的时间改变形状和迁移方向，只有当DNA分子达到一定构型，沿新

的泳动方面伸直后，才能向前迁移。DNA分子的转向时间与其大小关系极为密切，分子越大，分子构型转换所需时间就越长，转变迁移方向的时间也就越长。对于不同大小的DNA大分子，其改变泳动方向所需的时间不等，迁移速度的快慢也就不等，因此就可以按DNA分子量大小使其分离开来。根据欲分离的DNA分子大小适当调节电场方向的相交角度、电压及脉冲时间等参数，即可将各种分子量大小不同的分子分开。 8、假基因的分类及其发生机理。

与正常功能的基因序列相似，但无转录功能或转录产物无功能的基因称假基因( pseudogene)。根据是否保留相应功能基因的间隔序列(如内含子) , 假基因分两大类:一类保留了间隔序列，称为非加工假基因(non-processed pseudogene)，通常因基因的复制修饰,如点突变、插入、缺失和移码突变而导致复制后的基因在转录和翻译时出现异常,丧失正常功能，它与功能基因一般在同一染色体上, 也称复制型假基因( duplicated pseudogene)。假基因中大多数则缺少间隔序列的称为已加工假基因(processed pseudogene)，主要是转录过程中mRNA 以cDNA 的方式重新整合进入基因组( 很可能发生在生殖细胞中)，在长期进化选择过程中因为随机突变积累而丧失功能，通常这种假基因无内含子，两边有小的侧翼定向重复序列(flanking direct repeat)，3'端多具多聚腺苷酸尾。 9、简述CpG岛与DNA甲基化调控。

大约有一半的人类基因富含CpG 的顺序，称为CpG岛(CpG island)，CpG 岛常位于转录调控区或其附近，主要存在于看家基因和一些组织特异性表达基因。在正常组织，除印记基因和失活的X染色体外，包括启动子区在内的基因5′端CpG 岛大部分是非甲基化的。DNA甲基化与基因表达呈负相关，DNA甲基化调控基因表达直接的机制可能是因为甲基从DNA分子的大沟中突出，阻止了转录因子与基因相互作用，还可能直接抑制RNA聚合酶活性而抑制基因的表达。间接的机制包括两种类型：①与甲基化DNA结合蛋白结合；②改变染色质结构，这都间接阻碍转录因子与DNA结合而抑制转录。DNA甲基化对胚胎发育非常重要，与X染色体失活，基因组印记，特别是肿瘤密切相关。

10、作为一种遗传标记，人类短串联重复序列（STR）的主要用途有哪几个方面？

主要用途①人类基因遗传图谱的制作。②目的基因筛选和基因诊断。通常目的基因若与STR位点有连锁关系, 则其位置与STR位点邻近, 故通过对STR附近区域克隆测序, 就可能发现目的基因。通过家系和对照研究, 运用连锁和相关分析, 可以找到与疾病高度相关的STR位点。③法医学个体识别和亲权鉴定。法医案例中, 对于量极少和降解严重的生物检材, 通过PCR进行STR位点扩增并将几个STR 位点联合起来分析, 可得到相当高的累积个体识别率和父权排除率。因而STR用于法医学领域有着广阔的前景，为司法侦案、破案提供有利的科学依据。 11、人类单核苷酸的多态性（SNP）的特点及主要用途有哪几个方面？

疾病的连锁分析与基因的定位：包括复杂疾病（如骨质疏松症、糖尿病、心血管疾病、精神性紊乱、各种肿瘤等）的基因定位、关联分析，并可用于遗传病的单倍型诊断。

指导用药和药物设计：SNP多态性能充分反映个体间的遗传差异。通过研究遗传多态性与个体对药物敏感性或耐受性的相关性, 可以阐明遗传因素对药物效用的影响, 从而对医生针对性的用药和药物的开发提供指导和依据。

用于进化和种群多样性的研究：生物界的进化及进化过程中物种多样性的形成与基因组的突变和突变的选择密切相关, 构建整个基因组的SNP 图谱对于直接研究人类的起源、进化具极大意义。对比人群之间SNP 图谱的异同情况可以对人类的起源、迁移等作出估计, 从而理清人类进化过程中源与流的问题。 12、人类基因组研究的主要内容是什么？

人类基因组研究主要包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学，又称后基因组研究。

结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，通过基因作图、核苷酸序列分析确定基因组成、基因定位的科学，包括规模化地测定蛋白质、RNA及其它生物大分子的三维结构等内容,以获得一幅完整的、能够在细胞中定位以及在各种生物学代谢途径、生理途径、信号传导途径中全部蛋白质在原子水平的三维结构全息图。功能基因组学代表基因分析的新阶段，是利用结构基因组学提供的信息研究基因功能，使人们有可能在基因组学、蛋白质组学、分子细胞生物学以致生物体整体水平上理解生命的原理。对疾病的防治和机理的阐明有重要应用意义。

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