生物化学实验操作手册(生物科学专为业)(3)

为了提高分辨率，纸层析可用两种不同的展开剂进行双向展层，双向纸层析一般把滤纸裁成长方形或方形，一角点样，先用一种溶剂系统展开，吹干后，转90度，再用第二种溶剂系统进行第二次展开。这样，单向纸层析难以分离清楚的某些物质(Rf值很接近)，通过双向纸层析往往可以获得比较理想的分离效果。 【薄层层析】

薄层层析是利用玻璃板、塑料板、铝板、聚酰胺膜等作为固定相的载体，在板上涂一薄层不溶性物质为固定相，再把样品涂铺在薄层的一端，然后用合适的溶剂作为流动相(展开剂)。薄层层析因固定相涂布物质的不同，可分成吸附薄层层析、离子交换薄层层析和分配薄层层析等三种。通常说的薄层层析就是指吸附薄层层析。有关薄层层析的基本原理与Rf的计算与纸层析基本相似。现就薄层层析时应注意的事项简述如下： 1．吸附剂的选择

吸附剂的选择是否合适是吸附层析的关键。常用吸附剂有硅胶、氧化镁、氧化铝、硅藻土、纤维素等。硅胶为微酸性吸附剂，适合分离酸性和中性物质；氧化铝和氧化镁是微碱性吸附剂，适合分离碱性和中性物质；硅藻土和纤维素为中性吸附剂，适合分离中性物质。 2．吸附能力

一般用活度来表示吸附剂的吸附能力。吸附能力主要受吸附剂含水量的影响。其由强到弱程度以I，II， III，Ⅳ，V 表示。吸附剂活度强时，能吸附极性较小的基团；吸附剂活度弱时，对非极性基团吸附能力也较强。一般利用加热烘干的办法，减少吸附水分，从而增强其活度。通常，分离水溶性物质时，因其本身具有较强极性，故吸附剂要弱一些：相反，分离脂溶性物质时，吸附剂活度要强一些。

3．颗粒大小

无论那一种薄层层析，其吸附剂颗粒的大小和均匀性，是保证每次实验保持Rf值恒定的基础，一般使用吸附剂颗粒直径为无机类 0.07～0.1mm(150～200目)，有机类0.1～

0.2mm(70～140目)。颗粒太粗，层析时溶剂推进快，但分离效果差，而颗粒太细，层析时展开太慢，易产生斑点不集中并有拖尾现象。

薄层层析的优点是：设备简单，操作容易，层析展开时间短，分离效率高，可用腐蚀性的显色剂并可在高温下显色。

纸层析和薄层层析均可用于氨基酸、肽、核苷酸、糖类、脂类和激素等物质的分离和鉴定。

【离子交换层析】

离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子有不同的亲和力，来分离混合物中各种离子的层析技术。作为固定相的离子交换剂，根据其不溶性物质(母体的化学本质)可以分为以下几类：

第一类是在纤维素分子结构上，连接一定的离子交换基团生成的离子交换纤维素。如DEAE-纤维素(二乙基氨乙基纤维素)、羧甲基(CM)纤维素、TEAE-纤维素(三乙基氨乙基纤维素)、GE-纤维素(胍乙基纤维素)等。

第二类以不溶性的人工合成高分子为母体的离子交换树脂。如华东强酸阳42#、强酸732、AmberliteIR～100、Dowex 50、AmberliteIRC-50、神胶800等。

第三类是以葡聚糖凝胶为母体，结合一定的离子基团生成的离子交换葡聚糖凝胶。 如DEAE-Sephadex A25、A50，CM--Sephadex C25，SP-Sephadex C25,QAE-SephadexA25、A50等。

以上各类离子交换剂，还可根据其所含酸性或碱性基团的解离能力的强弱，可进一步分成强酸型和弱酸型以及强碱型和弱碱型。 离子交换剂的作用原理如下：

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阳离子交换剂分子中具有酸性基团，能和流动相中的阳离子进行交换。

R—S03H+ Na== R—S03 Na+ H

阴离子交换剂分子中具有碱性基团，能和流动相中的阴离子进行交换。

+--+- - R—N (CH3)30H+ Cl==R—N( CH3)3C1+ OH

流动相中，不同离子化合物带电荷多少不同，与离子交换剂相互作用的强弱也不同，当它们被结合到固定相交换基团上以后，可以用提高流动相中离子强度或改变pH的办法，把它们从离子交换柱上依次洗脱下来，达到分离纯化的目的。在实际工作中，可根据被分离物质所带电荷的种类、分离物分子的大小、数量等选用适当类型的离子交换剂。 离子交换层析时应注意以下几点： 1．选择合适的离子交换树脂

被分离的物质为无机阳离子或有机碱时，选用阳离子交换树脂；若是无机阴离子或有机酸时，选用阴离子交换树脂。交换树脂颗粒大小：离子交换树脂多为200～400目，纤维素离子交换剂为100～325目。分离用的树脂一般以直径较小为宜，因粒度小，表面积大，分离效率高。但粒度过小，装柱时太紧密，流速慢，需提高洗脱压力。

2．交换剂的处理

离子交换树脂出厂时为干树脂，使用时需用水或溶液浸透使其充分吸水溶胀，然后减压去气泡。倾去浮在溶液中的小颗粒树脂，再用去离子水洗至澄清，使用前用所需的pH和离子强度的缓冲液平衡，纤维素交换剂使用前处理原则基本同上。离子交换树脂和纤维素交换剂，均可再生后反复使用。再生方法为交换树脂使用后，将交换树脂泡入稀酸或稀碱溶液中，一段时间后用蒸馏水洗至中性；或用稀酸、稀碱缓缓流过交换柱。然后再洗至中性。离子交换纤维素使用后用2mol／L NaOH洗涤，然后用水洗净碱液，再用缓冲液平衡，供下次实验用。 3．装柱

一般层析柱选择的原则是柱的高度与直径之比以10：l到20：l为宜。装柱方法一般采用重力沉降法，其关键是交换剂在柱内必须分布均匀，严防脱节和产生气泡，柱中交换剂表面必须平整。

4．洗脱

一般是根据所用洗脱液比吸附物质具有更活泼的离子或基团，从而把吸附物质顶替出来，利用此原则选择各种洗脱液。若分离的是非单一物质，除正确选择洗脱液外，还可采用控制流速和分段收集的方法获得尽可能单一物质。对一些复杂组分的分离，可采用浓度梯度洗脱或pH梯度洗脱。

【凝胶层析】

凝胶是一类具有三维空间多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收一定量溶液后溶胀成一种柔软富有弹性，不带电荷，不与溶质相互作用的惰性物质，以它作为固定相的层析称为凝胶层析。层析用的凝胶大多为人工合成。目前应用最多的为葡聚糖凝胶(Sephadex)，它是一种次环氧氯丙烷作交联剂交联聚合而成的右旋糖苷珠形聚合物。聚合物具有主体多糖网状结构，其网孔大小与交联度有关，交联度越大，网状结构越致密，网孔的孔径越小，交联度越小，网状结构越疏松，网孔的孔径越大。由于被分离物质的分子大小(直径)和形状不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而最后流出层析柱。可见凝胶层析中的凝胶起着分子筛的作用，因而又称为分子筛层析，或排阻层析。

葡聚糖凝胶(Sephadex)不溶于水，但能吸水膨胀，其吸水量与交联度成反比，在Sephadex后面缀上G-X作为交联度的标记。交联度越小，吸水量越大，X值越大。实际上X值约为该胶粒吸水量的10倍。例如：Sephadex G-50和G-100，吸水量分别为5ml水／g凝胶与10ml／g凝

-

+

+

-+

+

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胶。此外交联度大，机械强度大，较能容忍较高压力，易采用高流速；而交联度小的如SephadexG-150，G-200，则机械强度小，易被压缩。使用时流速需慢些，一般每分钟流速不大于2.0ml。

此外尚有以N，N’-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂将丙烯酰胺聚合而成的聚丙烯酰胺凝胶，其商品名为生物胶P(Bio-Gel P)；琼脂糖凝胶是由D--乳糖和3，6无水一L乳糖残基组成的多聚糖，市售有Bio-Gel A和Sepharose；交联琼脂糖(Sepharose CL-2B，Sepharose CL-4B及Sepharose CL-6B)等。各种凝胶由于交联剂的种类和比例不同，因而同一类凝胶可分成若干种类，分离大分子物质的性能也不一样。使用时必须根据被分离物质分子的大小、形状和分离目的选择不同类型的凝胶。 【亲和层析】

亲和层析是以能与生物高分子进行特异结合的配基作为固相．对混合物中某一生物高分子进行一次性分离纯化的层析技术。

生物高分子具有能与其结构相对应的专一分子进行可逆性结合的特性。如：酶与底物、产物、辅酶、抑制剂和变构调节剂结合，激素与受体结合，抗原与相对的抗体结合，RNA与互补的DNA结合等。把作为配基(载体)的专一分子(如酶的底物、辅酶，抗原的互补抗体)以共价健连接到不溶性载体(如纤维素、葡聚糖凝胶)上，使之固相化，然后将固相化的载体装入层析柱，作为层析的固定相，把含有一种或数种生物高分子(如蛋白质)混合液加到柱上，这时混合物中只能与不溶性配基具有高度亲和性的蛋白质被吸留，其他不能与配基结合的蛋白质则不受阻碍地直接从柱中流出。再用缓冲溶液洗脱沾附在配基表面的非亲和吸附物，改变洗脱液，把特异吸附的蛋白质从不溶性配基上解离和洗脱下来。

作为配基(载体)最广泛应用的是琼脂糖凝胶，制品有珠状琼脂糖凝胶(sepharose 2B、4B和6B)，活化后即可作为亲和吸附的载体。如AH--Sepharose 4B；CH—Sepharose和活化的CH-Sepharose 4B等。其中溴化氰(CNBr)活化的Sepharose 4B是亲和层析中使用最广泛的载体。

第五章 电泳法

【电泳的基本原理】

带有电荷的颗粒在电场中泳动的现象叫电泳。带正电荷的泳向负极，带负电的泳向正极。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。混合物中各组分在电场中的泳动速度，首先和本身所带的净电荷多少、分子量大小和形状有关。一般来说，带电越多，分子量（颗粒）越小而且是球形的，则泳动速度就快。反之，则慢。因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同，而达到分离鉴定各组分的目的。 【影响电泳的主要因素】

1．电泳介质的pH

当介质的pH等于某种两性物质的等电点时，该物质处于等电状态，即不向正极或负极移动。当介质pH小于其等电点时，则呈正离子状态，移向负极；反之，介质pH大于其等电点时，则呈负离子状态，移向正极。因此，任何一种两性物质的混合物电泳均受介质pH的影响，即决定于两性物质的带电状态及其量，为了保持介质pH的稳定性，常用一定pH的缓冲液，如分离血清蛋白质常用pH 8.6的巴比妥或三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液。 2．缓冲液的离子强度

离子强度对电泳的影响是：离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。如离子强度过低，缓冲液的缓冲量小，不易维持pH的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量(压缩双电层)使电泳速度减慢。所以常用离子强度为

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0.02～0.2之间。溶液离子强度的计算：

I=1／2∑CiZ1

I=离子强度 Ci=克分子浓度(指离子而言) Z21=离子的价数 溶液中不能解离的或极少解离的物质不应计入离子强度。 3．电场强度

电场强度和电泳速度成正比关系。电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。如纸电泳的滤纸长15cm，两端电压(电势差)为150V，则电场强度为150／15=10 V／cm，电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快。电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应可使蛋白质变性而不能分离。 4．电渗作用

在电场中，液体对固体的相对移动，称为电渗。如滤纸中含有表面带负电荷的羧基，溶液则向负极移动。由于电渗现象与电泳同时存在，所以电泳的粒子移动距离也受电渗影响，如纸上电泳蛋白质移动的方向与电渗现象相反，则实际上蛋白质泳动的距离，等于电泳移动距离减去电渗距离。如电泳方向和电渗方向一致，其蛋白质移动距离，等于二者相加。电渗现象所造成的移动距离可用不带电的有色染料或有色葡聚糖点在支持物的中间，观察电渗方向和距离。

【区带电泳的分类】

1．按支持物物理性状不同，可分为：

(1)滤纸及其他纤维素膜如乙酸纤维膜、玻璃纤维膜、聚胺纤维膜电泳。 (2)粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。

(3)凝胶电泳，如琼脂糖、琼脂、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 (4)丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。 2．按支持物的装置形式不同，可分为：

(1)平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式。 (2)垂直板式电泳。

(3)连续流动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电级，缓冲液和样品自顶端下流，与电泳方向垂直。可分离较大量的蛋白质。以后有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸，分离效果更好。 3．按pH的连续性不同，可分为：

(1)连续pH电泳：电泳的全部过程中缓冲液pH保持不变。如纸电泳、乙酸纤维膜电泳。 (2)非(不)连续pH电泳：缓冲液与支持物之间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳、等电聚焦电泳、等速电泳等，能使分离物质的区带更加清晰，并可作ng级微量物质的分离。 不连续电泳与连续电泳的主要区别在于前者①有两层不同孔径的凝胶系统；②电极槽中及两层凝胶中所用的缓冲液pH值不同；③电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。而后者在这三个方面都是单一或是均匀的。 【几种常见的电泳方法】

1. 纸电泳和醋酸纤维素薄膜电泳

纸电泳是以滤纸为支持物进行电泳,现已基本被醋酸纤维素薄膜电泳所代替。

醋酸纤维素薄膜电泳具有分离速度快，区带清晰，操作简便等优点。例如血清中含多种蛋白质，用醋酸纤维素薄膜电泳可分为五个区带，经固定染色后不仅可看到清晰的色带，而且可定量，计算出各种蛋白质的百分比。

2．琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是从琼脂中精制分离出的胶状多糖。琼脂糖凝胶作为生命科学和相关领域研究中的重要介质材料是由于它的特殊物理化学特性。它作为电泳介质有如下优点：

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1） 琼脂糖凝胶是具有大量微孔的基质，其孔径尺寸取决于它的浓度。浓度越低，孔径越大。

2） 琼脂糖具有较高的机械强度，允许在1%或更低的浓度下使用。 3） 琼脂糖无毒，不给操作者带来不便。

4） 染色、脱色程序简单、快速，背景色较低。

5） 琼脂糖凝胶很容易干成薄膜，适于光密度扫描和永久保存。 3．聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis)是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳，这种凝胶由丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N’-甲叉基(亚甲基)双丙烯酰胺(N，N’- methylene-bis-acrylamide，简称Bis)聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，弹性大，透明，化学稳定性高，无电渗作用，设备简单，样品用样量少(1～lOO μg)和分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成孔径大小不同的凝胶，可用于蛋白质、核酸等物质的分离、定性和定量分析。还可结合去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)，以测定蛋白质亚基分子量。 凝胶浓度的选用如表1-5-1：

表1-5-1 分子量范围 <10000 蛋 10000～40000 白 40000～100000 质 100000～500000 >500000 <10000 核 10000～100000 酸 100000～2000000

根据凝胶形状可分为盘状电泳和板状电泳。盘状电泳是在直立的玻璃管内，利用不连续的缓冲液的pH值进行电泳，同时，由于样品混合物被分开后形成的区带非常窄，呈圆盘状，故而得名。板状电泳(垂直或水平)是将丙烯酰胺聚合成方形或长方形平板状，平板大小和厚度视实验需要而定。垂直平板电泳有如下优点：①表面积大，易于冷却，便于控制温度；②能在同一凝胶板上，相同操作条件下，同时点加多个样品，便于相互比较；③一个样品在第一次电泳后，可将平板转90度进行第二次电泳即双向电泳；④便于用各种方法鉴定(如放射自显影等)。其缺点是制备凝胶时操作较复杂，电压较高，电泳时间较长。 4．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳是根据蛋白质分子(或其他生物大分子)所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率而分离成若干条区带。然而有时两个分子量不同的蛋白质，由于其分子大小的差异，被他们所带电荷的差别补偿而以相同的速度向阳极移动，因而不能达到分离的目的。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳就是设法将电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度。

SDS是一种阴离子表面活性剂，它能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质的疏水部分，形成SDS-蛋白质复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS／g蛋白质。由于SDS带有负电荷，使各种SDS-蛋白质复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同蛋白质分子原有的电荷差别。这样的SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而只与

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凝胶浓度％ 20～30 15～20 lO～15 5～10 2～5 15～20 5～10 2～2.6

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