生物化学实验操作手册(生物科学专为业)(2)

欲使沉淀与母液分开，过滤和离心都可以达到目的，但是当沉淀粘稠，或颗粒小得可以通过滤纸时，则需选用离心法。特别是溶液量小又需定量测定时，离心分离法更具优越性。离心分离是利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分的方法，是实验室常规采用的技术。

离心机种类很多，转速少于6000r/min的为低速离心机；转速低于25000r/min的为高速离心机；转速超过30000r/min的为超速离心机。根据离心机的用途不同，还可以将离心机分为分析离心机和制备离心机。其中制备离心技术又分为分级离心技术和密度梯度离心技术。用于生物大分子分离的，还有超速离心技术。本节将简要叙述一般离心机的使用方法(特殊用途的离心机请参阅相关的说明书)。 低速离心机的使用：

1．离心前检查：取出所有套管，起动空载的离心机，观察是否转动平稳；检查套管有无软垫，是否完好，内部有无异物；离心管与套管是否匹配。

2．离心原则

平衡：将一对离心管放入一对套管中，置于天平两侧，用滴管向较轻一侧的离心管与套管之间滴水至两侧平衡。

对称：将已平衡好的一对套管置于离心机中的对称位置。

3．离心操作

(1)对称放置配平的一对套管后，盖严离心机盖, 开启电源。

(2)调节转速调节钮，逐渐增加转速至所需值，当离心机转速达到要求时，开始计时。 （3）达到离心时间后，缓慢将转速调回零。断开电源，当离心机自然停止后，取出离心管和离心套管。

(4)倒去离心套管内的平衡用水，倒置于干燥处晾干。 4．注意事项

（1）离心机的起动、停止都要慢，否则离心管易破碎或液体从离心管中溅出。

（2）离心过程中，若听到特殊响声，应立即停止离心，检查离心管。若离心管已碎，应清除并更换新管；若管未碎，应重新平衡。

第二章 实验样品的制备

【血液样品】

1．全血

取清洁干燥的试管或其他容器，收集人或动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。常用剂量如下：草酸钾或草酸钠l?2mg；柠檬酸钠5mg；氟化钠5～10mg；肝素0.1～0.2mg。 抗凝剂宜先配成水溶液，按取血量的需要加于试管或适当容器内，横放，再蒸干水分(肝素不宜超过30℃)，使抗凝剂在容器内形成薄层，利于血液与抗凝剂的均匀接触。 取得的全血如不立即使用应储于4℃冰箱之中。 2．血浆

抗凝之全血在离心机中离心，使血球下降，如此得到的上清液即为血浆。质量上乘的血浆应为淡黄色。为避免产生溶血，必须采用干燥清洁的采血器具和容器，并尽可能地少振摇。 3．血清

收集不加抗凝剂的血液，室温下自然凝固，所析出的草黄色液体，即为血清。制备血清时血凝块收缩析出血清，大约需要3小时。为促使血清尽快析出，必要时可以采用离心的方

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法缩短分离时间，并且可得到较多的血清。

制备血清同样要防止溶血，所以，应用的器具应当干燥清洁。而且血清析出后宜用干净的玻璃棒轻轻分离血凝块与容器壁的粘连，及时吸出析出的血清。

【组织样品】 在生化实验中，经常利用离体组织研究各种物质代谢途径和酶系的作用。或者从组织中分离、纯化核酸、酶以及某些有意义的代谢物质进行研究。

但是，在生物组织中，因含有大量的催化活性物质，离体组织的采集必需在冰冷条件下进行，并且尽快完成测定。否则其所含物质的量和生物活性物质的活性都将发生变化。 一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出所需脏器或组织，除去脂肪和结缔组织之后，用冰冷生理盐水洗去血液，再用滤纸吸干，称重后，按试验要求制成匀浆或者组织糜。 组织糜：迅速将组织剪碎，用捣碎机绞成糜状，或者加入少量黄砂于乳钵中，研磨至糊状。

组织匀浆：取一定量新鲜组织剪碎，加入适量匀浆制备液，用高速电动匀浆器或者玻璃匀浆器磨碎组织。由于匀浆器的杵头在高速运转中会产生热量，因此在制备匀浆时，需将匀浆器置于冰水中。

常用的匀浆制备液有生理盐水、缓冲液和0．25mol／L的蔗糖液等，可根据实验的要求，加以选择。

组织浸出液：上述组织匀浆液再经过离心分离出的上清液就是组织浸出液。

第三章 分光光度法

光是由光子所组成，光线就是高速向前运动的光子流，光的本质是一种电磁波，传播过程呈波动性质，具有波长和频率的特征。将电磁波按波长(或频率)顺序排列起来，即得：

γ射线 X射线 紫外线 可见光 红外线 无线电用电磁波 人肉眼可见的光线称可见光，波长范围在400～760nm，波长范围在200～400nm为紫外光区(波长<400nm的光线)，波长范围在760～500000nm为红外区(波长>760nm??)。可见光区的电磁波，因波长不同而呈现不同的颜色，这些不同颜色的电磁波称单色光，单色光并非单一波长的光，而是一定波长范围内的光，太阳及钨丝灯发出的白光，是各种单色光的混合光(复合光)，利用棱镜可将白光分成按波长顺序排列的各种单色光，即红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等，这就是光谱。

一切物质都会对某些波长的光进行吸收，而物质对不同波长的射线，表现为不同的吸收现象，这一性质称为选择性吸收。有色溶液之所以呈现不同颜色，就是由于这种对光的选择性吸收所致。某些无色物质虽对可见光无吸收作用，但也能选择性地吸收在可见光范围外的部分光能，即可吸收特定波长的紫外线或红外线。物质的吸收光谱与它们本身的分子结构有关，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同。因此每种物质都具有其特异的吸收光谱，在一定条件下，其吸收程度与该物质浓度成正比。故可利用各种物质的不同的吸收光谱特征及其强度对不同物质进行定性和定量的分析。吸收光谱的测定可用来检测各种不同的物质。

分光光度法的原理

分光光度法，常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其基本原理是根据Lam—bert和Beer定律。

1．Lambert定律

一束平行单色光垂直照射于一均匀物质(溶液)时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光线强度的减弱也愈显著。

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2．Beer定律

当一束单色光通过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若溶液的厚度不变，则溶液浓度C愈大，光吸收愈大，透射光线强度的减弱也愈显著，光强度减弱的量与溶液浓度增加量成正比。

3．1ambert-Beer定律(又称吸收定律)

A=KCL A=-1gT

A为吸光度(光密度、消光度) C为溶液的浓度 L为溶液的厚度

其中K为常数，又称消光系数(extinction coefficint)，表示物质对光线吸收的本领， 其值因物质种类和光线波长而异。对于相同物质和相同波长的单色光则消光系数不变。 4．待测样品浓度计算

根据lambert--Beer定律，如果单色光的波长、溶液的性质和溶液的厚度一定时，用一个已知浓度的标准液和一个未知浓度的待测液进行比色分析就可以得出下列运算公式： A标：KC标L = A样：KC样L 由于是同一类物质及相同光径，故 A样／A标=KC样L／KC标L=C样／C标 C样=A样／A标·C标

式中C样= 待测样品浓度，A样= 待测样品吸光度。

C标= 标准溶液浓度，A标= 标准溶液吸光度。 根据上式可知，对于相同物质和相同波长的单色光(消光系数不变)来说，溶液的吸光度和溶液的浓度呈正比。故己知标准溶液的浓度及吸光度按公式可算出测试样品溶液的浓度。 【分光光度计的结构】

分光光度计的种类很多，其基本原理及结构基本相似，一般都包括下列几个部件，如下图所示。

1．光源

一个良好的光源要求具备发光强度高、光亮、稳定、光谱范围较宽和使用寿命长等特点。 分光光度计上常用的光源有钨灯和氢灯(或氘灯)，前者适用于340～900nm范围的光源，后者适宜于200～360m的紫外光区，为了使发出的光线稳定，光源的供电需要由稳压电源供给。

2．单色器

单色器是将混合光波分解为单一波长光的装置，多用棱镜或光栅作为色散元件，它们能在较宽光谱范围内分离出相对纯波长的光线，通过此色散系统可根据需要选择一定波长范围的

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单色光，单色光的波长范围愈狭，仪器的敏感性愈高，测量的结果愈可靠。

3．狭缝

狭缝是由一对隔板在光通路上形成的缝隙，通过调节缝隙的大小调节入射单色光的强度，并使入射光形成平行光线，以适应检测器的需要，分光光度计的缝隙大小是可调的。 4．吸收池(或称比色杯、比色皿、比色池)

一般由玻璃或石英制成。

在可见光范围内测量时，选用光学玻璃吸收池：在紫外线范围内测量时必须用石英池。 注意保护比色杯的质量是取得良好分析结果的重要条件之一，吸收池上的指纹、油污或壁上的一些沉积物，都会影响其透光性，因此务必注意仔细操作和及时清洗并保持清洁。 5．检测系统

主要由受光器，和测量器两部分组成，常用的受光器有光电池、真空光电管或光电倍增管等。它们可将接收到的光能转变为电能，并应用高灵敏度放大装置，将弱电流放大，提高敏感度。通过测量所产生的电能，由电流计显示出电流的大小，在仪表上可直接读得A值，T值。较高级的现代仪器，还常附有电子计算机及自动记录仪，可自动描出吸收曲线。

第四章 层析法

层析技术是近代生物化学最常用的分离技术之一。层析系统包括两个相，一个称为固定相，另一个称为流动相。当以流动相流过加有样品的固定相时，由于样品各组分的理化性质（吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差异，受固定相的阻力与流动相的推力的影响不同，因而各组分在固定相与流动相之间的分配也不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。配合相应的光学、电学和电化学检测手段，可用于定性、定量和纯化某种物质，其纯度高达99％。层析法是分离率、灵敏度(pg～fg级)、选择性均高的一种分离方法，尤其适合样品含量少，而杂质含量多的复杂生物样品的分析。 固定相可以是固体也可以是液体，但这个液体必须附载在某个固体物质上，该物质称载体或担体(Support)。同样流动相可以是液体也可以是气体。 【分类】

1．按层析原理分类

(1)吸附层析(Adsorption Chromatography)固定相是固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力的差别而分离。

(2)分配层析(Partition Chromatography)固定相为液体，利用各组分在两液相中分配系数的差别或溶解度不同使物质分离。

(3)离子交换层析(Ion Exchanger Chromatography)固定相为离子交换剂，利用各组分对离子交换剂的亲和力不同而进行分离。

(4)凝胶层析(Gel Chromatography)固定相为多孔凝胶，利用各组分在凝胶上受阻滞的程度不同而进行分离。

(5)亲和层析(Affinity Chromatography)根据生物特异性吸附进行分离，固定相只能和一种待分离组分有高度特异性的亲和能力者结合，而与无结合能力的其他组分分离。 2．按操作方式不同分类

(1)纸层析(Paper Chromatography)以滤纸作为液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到组分分离目的。

(2)薄层层析(Thin Layer Chromatography)以一定颗粒度的不溶性物质，均匀涂铺在薄板上，点样后，用流动相展开，使组分达到分离。 (3)柱层析(colunm Chromatography)将固定相装柱后，使样品沿一个方向移动，以达到

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分离目的。

3．几种层析法 【纸层析】

用滤纸作为支持物的层析法，称为纸层析。纸层析结果的好坏除了与选用展开剂的种类、实验中的点样量多少、点样时是否扩散和实验条件是否稳定有关外，还与所用层析滤纸的质量好坏密切相关。对层析用滤纸的要求是：质地均匀、厚薄均一、机械强度好、平整、无折痕、无明显纵向和横向纸纹等。层析常用的滤纸有whatman和国产新华层析滤纸。根据层析快慢及纸厚度可分若干型号。

表l-4-1新华层析滤纸的规格和性能 型号 l 2 3 4 5 6

由于纸层析是以滤纸作为惰性支持物。滤纸纤维与水有较强的亲和力，约能吸收20％～22％的水，其中部分水与纤维素羟基以氢健形式存在，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力很小，所以滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相(展开剂)。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点上的溶质在水和有机相之间不断进行溶液分配，各种组分按其各自的分配系数进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。溶质在纸上的移动速度可用迁移率Rf值表示：

样品原点到斑点中心的距离

Rf= 样品原点到溶剂前沿的距离

可以根据测出的Rf值来判断层析分离的各种物质，当与标准品在同一标准条件下测得Rf值进行对照，即可确定该层析物质。

影响Rf值的因素有很多，除被分离组分的化学结构、样品和溶剂的pH值、层析中温度等外，流动相(展开剂)的极性也是一个重要因素。展开剂极性大，则极性大的物质有较大Rf值，极性小的物质Rf值亦小，反之亦然。常用流动相的极性大小依次排列如下：

水>甲醇>乙醇>丙酮>正丁醇>乙酸乙脂>氯仿>乙醚>甲苯>苯>四氯化碳>环己烷>石油醚 层析时，流动相不应吸取滤纸中的水分，否则改变分配平衡，影响Rf值。所以多数采用水饱和的有机溶剂如水饱和的正丁醇，被分离物质的不同，选择的流动相也不同。 纸层析法既可定性又可定量。定量方法一般采用剪洗法和直接比色法两种。剪洗法是将组分在滤纸上显色后，剪下斑点，用适当溶剂洗脱后，用分光光度计法定量测定。直接比色法是用层析扫描仪直接在滤纸上测定斑点大小和颜色深度，绘出曲线并可自动积分，计算结果。

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厚度(mm) 0.17 0.16 0.15 0.34 0.32 0.30 性能 快速 中速 慢速 快速 中速 慢速 备注 1．快速滤纸，因纸质疏松，斑点易扩散，适合于Rf值较大的样品和粘度较大的展开剂 2．慢速滤纸，斑点不易扩散，适合于Rf值较小的样品和粘度较小的展开剂，但展开时间较长 3．新华2、5号滤纸相当于whatmanI和III号层析滤纸

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