冷冻干燥中冻干制剂的一些问题综述(3)

3 一些保护剂在蛋白和多肽的冻干制剂中的应用

甘露醇是一种多羟基化合物，不仅可作为优良的骨架剂使用，也能兼作渗透性调节剂及蛋白质的冻干保护剂。氨基酸也是一种常见的蛋白质保护剂，研究发现，两种低浓度的氨基酸(谷氨酸和精氨酸)对PEG—rhlFNot2b的冻干保护作用非常显著，可能是因为：①二者一个是酸陛氨基酸，一个是碱性氨基酸，加人后使制剂具有了更好的缓冲能力，提高了蛋白质在冻干过程中的稳定性；②氨基酸的玻璃化转变温度相对高于非氨基酸缓冲剂，因此可能对冻干制剂的稳定性起到了一定作用；③ 氨基酸的另一种可能的保护机制是在冷冻过程中与蛋白共浓缩，从而起到了稀释和保护蛋白的作用；④在冷冻和冻干过程中，两性的氨基酸分子与蛋白分子之间发生特异的相互作用，保护蛋白不变性。

糖是最常见、使用最广泛的一类冻干保护剂，是蛋白质的非特异性稳定剂，在冻干的各个阶段均能对蛋白质起到一定的保护作用。蔗糖和海藻糖都是二糖，其中蔗糖化学性质稳定，多呈无定型结构，对阻止蛋白质二级结构改变以及冻干过程中及储存期内蛋白质的伸展和聚集起显著作用。蔗糖也有一个相对较高的玻璃化转变温度，使其在冷冻状态下与蛋白质共浓缩，起到了稀释蛋白质的作用，从而防止了聚合，并且维持蛋白分子的结构。另外蔗糖、海藻糖以及甘露醇上的羟基能替代部分结构水，与蛋白中的羰基和氨基结合形成的氢键使其在缺水的条件下仍能保持原有结构，而不丧失活性。蔗糖具有比其他多元醇更优越的水置换特性。海藻糖的作用与蔗糖相似，但比蔗糖具有更高的玻璃化转变温度和更低的引湿性，且更不具有还原性。 4 常用细胞冻干保护剂的应用

海藻糖在对生物膜保存的研究中发现,海藻糖无疑优于其它糖。这并非说其它糖类不能保护细胞膜,实际上蔗糖也能起到很好的保护作用,但它需要更高的浓度。在一般的冻干保存中,糖类一般与大分子聚合物共同使用,原因是大分子聚合物对细胞冻存过程中的相变没有影响,但可抑制细胞间的聚集和蛋白的融合,而糖类则可降低熔点值(Tm)。在细胞冻干过程中,对细胞磷脂囊泡的保护有2个必要条件:抑制囊泡间的融合,在干燥情况下降低Tm值。在溶液状态下,此种物质的Tm值为-1℃,若在不加海藻糖的条件下干燥,Tm上升到70℃,若在干燥过程中有海藻糖的参与, Tm被抑制到-20℃,冻干物质可维持在液晶状态并在复水过程中不

发生相变。大分子聚合物和糖类这2种物质的联合应用满足了细胞有效冻干的要求。当然,越来越多的研究证明,只有进入到细胞内部,海藻糖在冻干时才能对胞内蛋白和细胞膜起到有效的保护作用。

聚乙烯吡咯酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)是一种多聚体,它对生物体或生物大分子具有非特异性保护作用;同时它也是一种非渗透性保护剂,在细胞冻干保存中常与糖类一起,主要通过与糖类间的氢键作用和改变糖类的玻璃化温度发挥作用,不同浓度和不同分子量的PVP的作用不一样。大分子量的PVP能够更有效地抑制蔗糖的结晶作用,通过稳定糖类的玻璃化结构,这些多聚物还可以提高共同冻干的蛋白和肽类的稳定性。增加PVP的浓度和分子量也可以增加非结晶型糖类的物理稳定性。

盐类在冻干中的作用 溶液在结冰时,其中的溶质浓度必然会慢慢增大,盐类产生的电解质离子可明显降低其Tg值,比如在10%的葡聚糖、PVP、乳糖和蔗糖的溶液中加入2%的NaCl可使Tg值下降14~18℃。磷酸钠对Tg值的影响较小,但是当将10%的PVP溶液中加入1%~%的磷酸钠可以引起在低温热能曲线中的第2个玻璃化,暗示了在冻干液中的相分离。电解质诱导Tg值变化的最可能的机制是它可以增加冻干液中非冰冻水的含量,而这非冰冻水起到了增塑剂的作用,并且降低了Tg值。有些盐类会分离蛋白和PVP联合,在冰晶中把它们分成蛋白富集区和PVP富集相,这一结果强调了在冻干保护液中减少盐加入量的重要性。

为了获得在冻干前后形态一致和功能稳定的细胞,很多糖类或多聚物经常被用做溶液冻融和冻干过程中非特定蛋白质和膜的稳定剂,它们既是有效的低温保护剂,又是很好的冻干保护剂,它们对冻结的影响取决于种类和浓度。但是细胞种类很多,所含蛋白也不尽相同,而且物理化学性质各异,因此不同的细胞需要不同的保护剂。在选择冻干保护剂的配方时,必须进行大量严格的试验,这对任何一种细胞冻干工艺的探索都是一项极为重要的工作。 五 冻干制剂稳定性研究

我们这里只对多肽类和蛋白质的制剂的稳定性探究,多肽类药物冻干制剂在生产和贮存过程中,经常会出现药物失活现象,有时在其制剂表面还会出现凹凸不平或萎缩等现象，引起这些现象的因素很多。

首先是上述中谈到的玻璃态转化温度（Tg），在生产过程的第1、第2干燥阶

段以及储存过程中,药物温度都必须低于与其浓度变化相应的Tg,否则就会影响制剂稳定性,从而影响冻干制剂的外观和内在质量。但干燥温度过低,干燥时间就要延长。为了既保证药物在干燥过程中温度低于Tg,又缩短干燥时间避免能源浪费,最好的方法是提高药物溶液的Tg,即加入Tg高的保护剂,如甘露醇、海藻糖等。

其次是上述谈到的水分控制，冻干制剂中的剩余含水量,对于多肽及蛋白质类药物稳定性的影响很大,尤其对其活性的复性影响最大。一般认为其含水量越低,则Tg就越高,该制剂越能长期稳定地储存，但并不是剩余含水量越低越好。研究表明不同结构的多肽及蛋白质类药物的冻干制剂对于剩余含水量的需求是不一样的。就某一种多肽或蛋白质类而言,剩余含水量过高过低都不利于其稳定。追究其原因,可能是每种多肽类或蛋白质类药物都含有适合于一定剩余水分来稳定的基团,剩余含水量较低或过度的干燥可使多肽分子的这些基团(如极性基团或分子表面的氢键)变化而导致变性;过多的水分可使多肽及蛋白质类药物发生氧化变质的几率增多而导致变性。因此,控制适宜于多肽及蛋白质类药物的剩余含水量,这既能满足冻干制剂在保存期稳定的要求,又避免在生产中因过度干燥而引起能源浪费。

为了提高药品的稳定性,必须对药品在冻干过程中的损伤和保护机制进行进一步的研究,优化冻干工艺。预冻过程中一般认为主要是由机械效应和溶质效应引起。邬霞等研究了冷冻保护剂能避免超低温冷冻过程中的溶质效应。干燥阶段,应该在保证药物活性的条件下,选择能允许的最高温度进行第2阶段再干燥。在该过程中,为了将干燥应力的破坏作用降至最低需要加入干燥保护剂,包括保持玻璃化的干燥剂,以保证多肽分子表面的单层水分子不受到破坏。

干燥好的制剂出箱后要及时密封,否则与空气接触后容易吸潮、产生萎缩等现象。因此,干燥好的制剂在出箱前必须注意干燥箱温度要高于环境温度;需充入高纯氮气进行保护;并尽快进行密封处理。随着冷冻干燥机的不断改进,目前多采用箱内真空密封或充氮气密封。

冻干保护剂及其保护机制:从上述生产工艺过程中笔者得知,冷冻干燥是一个复杂的过程,其过程中产生冻结应力(包括枝状冰晶的形成,离子浓度的增加, pH值的改变和相分离等)和干燥应力(主要是指移去多肽分子表面单层水分子)等 都会使多肽及蛋白质类药物变性。为了防止药物变性,通常都在其制剂配方中都

添加了不同的保护剂,加入的这些保护剂一般应具有吸水性差、玻璃转变温度高、结晶率低和不含还原性基团等特性。常用的保护剂见表2。通常认为,无定型甘露醇具有使多肽及蛋白质类药物稳定的作用,而结晶态的甘露醇则没有稳定功能,如有文献报道,1%或更低浓度的甘露醇通过无定型结构的形成而阻止蛋白质药物的聚集,但是高浓度的甘露醇则易于形成结晶态而促进蛋白质药物的聚集。而与甘露醇或其它糖类相比,海藻糖的玻璃转化温度更高、引湿性和还原性更低,具有更广阔的应用前景。氨基酸也是常见的蛋白质保护剂之一,在冷冻过程中,低浓度的甘氨酸可通过抑制磷酸缓冲盐结晶所致pH值的改变而阻止蛋白质药物变性。

贮存温度可能是影响冻干药品稳定性的最重要因素之一。冻干药品贮存过程中,温度必须低于其Tg,如环境温度超过冻干制剂的Tg,药品的玻璃化状态被破坏,分子运动加快,无定形成分结晶增加,会出现塌陷、表面萎缩、结块、变硬、变色 等,同时制剂的多孔网状结构被破坏,复水能力减弱。但有时贮存温度不稳定比单纯高温对药物活性影响更大。残留水分是又一重要因素。总的来说,冻于品越干燥,含水量越低,其Tg就越高,越容易长期稳定地保存,但过度的干燥会使某些药品表面的氢键或极性基团因暴露而变性。干燥后的药品必须封口保存,以防止污染及回潮。不同药品对封口的要求也不一致,一般对活的微生物、毒株、菌种要求真空封口,对易氧化变质的药品可以采用充氮封口,一般药品可采用普通封口。冻干药品长期贮存时,封口胶塞对药品稳定性也有影响,是由于水分经胶塞进入瓶内使药品中残留水分增加所致。高压蒸气灭菌时水分也可经胶塞进入药品中。 六 冻干过程中和冻干后的一些问题汇总 1 喷瓶现象

喷瓶是影响冻干制剂外观质量的重要因素，喷瓶的原因主要在三个方面，药液中的气泡、预冻、干燥速率。

制品在分装过程中，当灌装机溶液分注入瓶中时，由于液体流速较快，形成一定量的气泡存在于瓶内液体中，此时应将装瓶液体放置一定时间让气泡充分逸出，否则旗袍被冻结在制品内部，当升华过程抽真空减压时，气体逸出带有部分制品黏附于瓶壁上。

冻结过程预冻温度不够低或保持时间不够长，未能使溶液全部固化，真空升华干燥时，溶液的温度至共晶点时，溶液和水同时结晶析出，液体沸腾，造成喷

瓶。应严格控制预冻温度，预冻温度比共晶点温度要低15摄氏度保持2~3h，就可以保证冻实。

升温过快造成制品上下温差过大，下部制品的结晶不是从固体到气体升华，而是从固体、液体到气体蒸发，形成喷瓶。这样就造成制品上不均匀、疏松，呈海绵状的理想外观，下部则呈硬结和不规则的空穴，严重时可造成产品报废。因此应该严格控制升华干燥阶段特别是在共晶点附近的升温速率，均匀且不宜过快。 2 结晶

冻干箱在预先冷却时箱内有许多水分结霜于隔板上，产品进箱时，霜从隔板中掉入产品中结晶中心，从而使产品结晶。产品预先加塞或加盖，或者产品进箱后再开机预冻。最近可能在研究全自动冻干机，实现冻干后自动压塞，同时期待着此设备能够解决不提前半压塞，解决结晶问题。 3 掉底

掉底发生在预冻抽空阶段，一般是未冻实的液体于真空下快速蒸发，沸腾放热时发生。放热时产品本身温度急降，达到共晶点温度，于瓶底接触的搁板层并没有以上蒸发冷冻特性，玻瓶承受不了短时间的如此大的温度。所以预冻阶段要冻实。 4 破瓶

玻璃瓶在均匀受热或受冷在一定温度下是不破碎的，但在不同部位施加不同温度形成一定温差，就会破碎。所以要缩小玻瓶各部分的温差，在冻干曲线上体现的是缩小隔板温度曲线和样品温度曲线之间的温度线差异。要控制样品温度和隔板温度的温差小于20℃，既缩短了冻干周期，也解决了破瓶和脱底现象。当然破瓶也和瓶子质量还有冻干机性能有关。 5 产品上升

与真空度有关，升华过程中，泵组真空度很大时，突然大开大蝶阀，箱内真空度会大幅上升，从而导致产品上升，在操作过程中先慢慢打开大蝶阀，再开罗茨泵。 6 分层

在升华过程中，停机10min以上或干燥箱漏气会导致分层，产品进箱时减检

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