产胞外蛋白酶菌株的筛选及环境因素对其产酶活性的影响(2)

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淡水渔业

１材料与方法

１．１材料与设备

。匕平板培养基：牛肉膏３兰：蛋白胨５ｇ／Ｌ，琼

脂拶ｎ，／一１．，ＮＭＩ．Ｉ

ＮａＣ５ｇ／Ｌ

，

ｐＨ

调至．～．９。７０

７２

ＬＢ培养基：胰蛋白胨１０ｇ／Ｌ，酵母提取物５

ｇ／Ｌ，氯化钠１０ｇ／Ｌ，ｐＨ调至７．０。

蛋白酶筛选培养基：酪蛋白１０ｇ／Ｌ，酵母膏

ｌ

ｇ／Ｌ，琼脂１５ｇ／Ｌ，ｐＨ调至７．２。

１．２菌株筛选

１．２．１土壤采集、菌株初筛

土壤与底泥采集于湖北省洪湖金地农业科技发展有限公司实验基地的稻田和鱼塘。按照《土壤微生物生态学及其实验技术》的方法【９Ｊ，制备土壤样品稀释液，进行涂布分离培养（３７℃，４８ｈ），选出不同菌落划线培养（３７℃，４８ｈ）。

１．２．２

目的菌株的筛选

将初筛菌株分别接种在蛋白酶筛选培养基上，

２４

ｈ后，将出现水解现象的菌株接种到ＬＢ液体培

养基，每瓶３０ｍＬ，３７℃恒温摇床培养（２００ｒ／ｍ）

４８ｈ后，取发酵液离心（８℃，１３０００ｒ／ｍ离心１０

ｍｉｎ）收集上清酶液，采用ｆｏｌｉｎ酚试剂显色测酶活¨０Ｊ，筛选高效产酶菌株。

将ＬＢ液体培养基与无菌蒸馏水按照２００：１比

例配制成营养水体，取具有较高产酶能力菌株上清酶液１ｍＬ，加入到２００ｍＬ配制水体中，设三个平行，并取一管加入等量经高压灭菌的ＬＢ液体培养基做对照水样，置于３０℃恒温培养４８ｈ后测含酶水样和对照水样的ＴＮ，ＮＯ，一Ｎ，ＮＯ；－Ｎ和ＮＨ。＋一Ｎ浓度，以观察菌株所产的胞外蛋白酶对水体中的有机氮转化能力；并利用微板和磷酸苯二钠法¨川检测所选菌株产碱性磷酸酶的能力。１．３菌株鉴定

产酶菌种的鉴定参照《细菌属的鉴定指导》和（（Ｂｅｒｇｅｒ７Ｓ

ＭａｎｎｕａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）

（９版）的方法进行¨２。１

３Ｉ。

１．４环境条件对菌株酶活的影响

１．４．１

温度条件对菌株酶活的影响分别将筛选菌株放置在２７、３７、４７、５７℃和

６７℃５个不同的温度环境中进行培养，４８ｈ后测定蛋白酶活性，以研究温度条件对筛选菌株产胞外蛋白酶活性的影响。

１．４．２

ｐＨ条件对菌株酶活的影响

利用缓冲液调整ＬＢ培养液的ｐＨ，形成ｐＨ为

万方数据

５在，３６７≮磊；景蔻譬卺麓：袅篙嚣耄

菌株产胞外蛋白酶活性的影响。

结果与分析

。”７。’。７。”。

２．１产酶菌株的分离、筛选和鉴定

初步筛选结果发现分离出来的９株菌株中，有５株能够产生透明水解圈，具有产蛋白酶能力，通过测定胞外蛋白酶活性，对筛选出来的５株细菌进

行复筛，结果如图ｌ所示。

３２．１５００

娄２．１０００

蚤２．０５００

嚣２．００００

蹩１．９５００山

陋１．９０００

ＰＲＯｌ

ＰＲ０２

ＰＲ０３

ＰＲ０８

ＰＲ０９

菌株

图ｌ

蛋白酶复筛酶活性大小比较

Ｆｉｇ．１

Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｒｏｔｅａｓｅ

ａｃｆｉｖｉｔｙ

实验结果显示，ＰＲ０１酶活性最高，达到

２．１２

Ｕ／ｍＬ。各菌所产蛋白酶活性相对已投入工业

生产的菌种（如地衣芽孢杆菌ＣⅢ，最高可达

２１０００

Ｕ／ｍＬ）‘１４］活性仍较低。不过，已有研究显

示来源于自然条件的菌株所产胞外酶活性均远远低于经过人工选育改造的菌种：赖欣等¨纠所分离得到的短小芽孢杆菌Ｂ一１５在最适产酶温度和ｐＨ下所产的蛋白酶活性只有２．０３Ｕ／ｍＬ。而Ｒａｏ等¨刮选育的自僵菌在最适合的产酶培养条件下，７天之内，蛋白酶活性最高可达到２８０．７２Ｕ／ｍＬ；如果应用了气升式生物反应器，４天之内便可以达到最高酶活性。对于产酶活性剂较低的菌株，可通过物理化学方法诱变选育、基因工程、蛋白质工程改造、发酵条件改良等¨５｜，进行人工定向或非定向的改造，增强其产酶能力和酶活性。

由于ＰＲ０１和ＰＲ０９酶活性较其他待筛选菌株高，将这两株菌株的酶液（ＰＲ０１蛋白酶活力为

２．１２１２

Ｕ／ｍＬ，ＰＲ０９蛋白酶活力２．１００８Ｕ／ｍＬ）加

入初水样中培养。初水样、培养４８ｈ后加入酶液的混合水样及未加入酶液的对照水样中各种氮素的初始浓度见表１。

实验结果显示，与初水样相比，对照组及加入酶液的混合水样组（ＰＲ０１菌株组和ＰＲ０９菌株组）的总氮和硝酸盐含量降低，氨氮含量明显增高，有机氮含量减少。

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