生物化学实验报告(3)

实验六 蛋白质的性质实验

实验（一）蛋白质的呈色反应

一、实验目的

1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式。 2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法 二、呈色反应： (一)双缩脲反应： 1.原理：

尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。

一切蛋白质或二肽以上的多肽部有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

2.试剂：

(1)尿素： 10克

(2)10%氢氧化钠溶液 250毫升 (3)1%硫酸铜溶液 60毫升 (4)2％卵清蛋白溶液 80毫升 3.操作方法：

取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10％氢氧化钠溶液约1毫升，振荡混匀，再加1％硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。

向另一试管加卵清蛋白溶液约l毫升和10％氢氧化钠溶液约2毫升，摇匀，再加1％硫酸铜溶液2滴，随加随摇，观察紫玫色的出现。

(二)茚三酮反应

1.原理： 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。

该反应十分灵敏，1：1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。

茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生成有色物质。

反应机理如下：

此反应的适宜pH为5—7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。

2.试剂：

(1)蛋白质溶液 100毫升

2％卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清：水＝1：9) (2)0.5％甘氨酸溶液 80毫升 (3)0.1％茚三酮水溶液 50毫升 (4)0.1％茚三酮—乙醇溶液 20毫升 3.操作方法：

(1)取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1毫升，再各加0.5毫升0.1％茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1—2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。

(2)在一小块滤纸上滴一滴0.5％的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴0.1％的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。

(三)黄色反应： 1.原理：

含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反应式如下：

多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。

2.试剂：

(1)鸡蛋清溶液 100毫升

将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用六层纱布过滤。 (2)大豆提取液 100毫升

将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状用纱布过滤。 (3)头发 (4)指甲

(5)0.5％苯酚溶液 50毫升 (6)浓硝酸 200毫升

(7)0.3％色氨酸溶液 10毫升 (8)0.3％酪氨酸溶液 10毫升 (9)10％氢氧化钠溶液 100毫升 3.操作方法：

向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10％氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。

(四)乙醛酸反应 1.原理：

在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质,反应机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相似的物质。

含有色氨酸的蛋白质也有此反应。 2.试剂：

(1)蛋白质溶液 100毫升 鸡蛋清：水＝1：20

(2)0.03％色氨酸溶液 10毫升 (3)冰醋酸 200毫升

(4)浓硫酸(分析纯) 100毫升 3.操作方法：

取3支试管。编号。分别按上表加入蛋白质溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸2毫升。混匀后倾斜试试管，沿管壁分别缓缓加入浓硫酸约I毫升，静置。观察各管液面间紫色环的出现。若不明显，可于水浴中微热

实验（二） 蛋白质的沉淀反应

一、蛋白质等电点的测定： 1.目的：

(1)了解蛋白质的两性解离性质。

(2)学习测定蛋白质等电点的一种方法 2.原理：

蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：

蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数日相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。

本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。

3.器材： (1)水浴锅。 (2)温度计。

(3)200毫升锥形瓶。 (4)100毫升容量瓶。 (5)吸管。 (6)试管。 (7)试管架。 (8)乳钵。 4.试剂：

(1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 200毫升

取0.4克酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研6，将所得的蛋白质悬波移入200毫升锥形瓶内，用少量40～50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10毫升1当量/升醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移至100毫升容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。

(2)1.00当量／升醋酸溶液 100毫升 (3)0.10当量／升醋酸溶液 100毫升 (4)0.01当量／升醋酸溶液 50毫升 5.操作方法：

(1)取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精确地加入各试剂，然后混匀。

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