生物化学实验报告(2)

实验四 总氮量的测定——凯氏定氮法

一、实验目的

1、学习微量凯氏定氮法的原理

2、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括标准硫酸铵含量的测定，未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。

二、实验原理

凯氏定氮法常用于测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氮基酸等）的含氮量。 天然的含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此时程称之为“消化”。

但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。 浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氮，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量，一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的当量数（相当于待测物中氨的当量数）计算出待测物中的氮量。

滴定时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂，其指示范围为pH5.2-5.6，将NH4H2BO3

的蓝色滴至原来H3BO3的蓝紫色即为终点。

本法适用范围0.2-1.0毫克氮。相对误差应小于2%。 三、材料、试剂与器具 （一）材料

人的血清或猪的血清 （二）试剂

1、浓硫酸（化学纯）

2、30%氢氧化钠（分析纯）溶液 3、0.9%NaCl溶液

4、硫酸钾—硫酸铜混合物：硫酸钾与硫酸铜（CuSO4、5H2O）以3：1（W/W）的配比混合研磨成粉末。

5、2%硼酸

6、混合指示剂的配制： 方法一：取50毫升0.1%甲烯蓝无水醇溶液与200毫升0.1%甲基红无水乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿色，变色范围窄且灵敏。

方法二：0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10毫升与0.1%甲基红乙醇溶液2毫升混和即成。

本指示剂的变色范围为

紫红色 灰色 绿色 7．0.01M HCl

8. 硼酸一指示剂混合液：取100毫升2%硼酸溶液，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈现紫红色即可。（约加1毫升左右混合指示剂）

9.标准硫酸铵溶液（0.3毫克氮/毫升）

（三）、器具

1、 凯氏烧瓶 2、 消化架

3、 吸量管（1毫升、2毫升） 4、 量筒（10毫升） 5、 凯氏定氮蒸馏装置

6、 微量滴定管（3毫升、5毫升，可读至0.02毫升） 7、 锥形瓶（50-100毫升） 8、 容量瓶（50毫升）

四、操作步骤 （一）样品的处理

血清样品：取人血（或猪血），放于离心管中，于冰箱中放置过液，次日离心除去凝血块，上层黄色透明清液即为血清。准确吸取血清1.0毫升加入0.9%NaCl 4.0毫升，仔细混匀备用。

固体样品：某一固体样品中的含氮量是100克该物质（干重中所含氮的克数）来表示（%）。 因此在定氮前，应将固体样品中的水份除掉。一般样品干燥的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。

在称量瓶中称入一定量的磨碎的样品，然后置105℃的烘箱内干燥4小时。用坩埚将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称量一次，直到两次称量的数量不变，即达恒重。 （二）消化

取2个50毫升的凯氏烧瓶，向第一号烧瓶内加2毫升稀释血清溶液（或4毫升核酸制品溶液，或200毫克固体粉末）。注意，用吸量管直接将溶液（或用试管加入固体样品）加至烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上，向2号烧瓶加入2毫升水作空白对照。

在每个烧瓶内加入硫酸钾—硫酸铜混合物约0.2克，浓硫酸3毫升，小瓷片两粒，摇匀。将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化。

在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明绿色为止。消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10毫升（注意慢加，边加边摇）。冷却后将瓶内容物转入50毫升的容量瓶中，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。 （三）蒸馏

1、仪器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。 蒸馏器有几种，应用前需熟悉其使用方法。使用方法如下：

开放自来水龙头，使水E进入G，从K管流出（水不宜开得过大以免水从G管溢出）。开放P3，使水进入A室，漏斗D中加蒸馏水约10毫升入B室。用拇指将管口按紧，同时开放P1，则B室中的水先从Y型管口冲出，随后A室中水经K管流出，一般情况下如此重复洗涤两次即可。若蒸馏器内有氨存在，则应加入蒸馏水后，不加样品蒸馏一次方可使用。（可用PH试纸检查。）

A为蒸气发生室，P3为其开关，P1为出水开关，B为蒸馏室，与出气室M相遇，M管插入盛有定量酸液的锥形瓶，B室内有Y型管，一端与A室相通，另一端经

P4与漏斗D相连，可经此将样品及试剂加入B室，F为指形冷凝管，E为进水管，水经F、G、K而流出，蒸馏时B室进消化好的样品及NaOH, 二者反应产生氨，B室经M管进入锥形瓶中的酸吸收。

2、滴定标准样品

先用标准硫酸铵溶液试验2~3次。蒸馏器洗净后，开放水龙头P3，使水进入A室，水放至A室球部即可。

取3个50毫升的锥形瓶，各准确加入10毫升硼酸（内加有混合指示剂）。用表面皿覆盖备用。

加样：用吸管吸取1毫升标准硫酸铵溶液，细心地由漏斗D倾入蒸馏室，再用蒸馏水1毫升清洗漏斗。取一个盛有硼酸—混合指示剂的锥形瓶，置于M管下，使管口恰好接触硼酸溶液，用量筒从漏斗D加入30%氢氧化钠8毫升，随即将P4夹紧，并往漏斗加入少量蒸馏水封闭。

蒸馏：用酒精灯加热（应用挡风板将灯围拢，维持火力恒定，沸腾不可高于Y管口以免A室溶液从Y管倒吸，待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起，继续蒸馏5分钟，然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸2分钟，最后用蒸馏水洗导管外壁，蒸馏完毕，取下锥形瓶，随即将蒸馏器洗净。）

3、样品及空白蒸馏：用吸量管分别吸取1毫升样品和1毫升蒸馏水按上述操作步骤进行蒸馏。

4、滴定：蒸馏完毕，用0.01N标准盐酸溶液滴定锥瓶内溶液至淡紫色或灰色，记录所用盐酸的量。 （四）计算

若样品中除有蛋白外，尚有其他含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要更复杂一些。首先需向样品中加入三氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后的样品的上清液中的含氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质的含量。

蛋白氮=总氮—非蛋白氮

蛋白质含量（克/%）=蛋白氮×6.25

五、注意事项

1、凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织，器官及食品等成组复杂样品的测定，只要细心操作都能得到精确的结果。其缺点是操作比较复杂，含有大量碱性氨基酸的蛋白质测定结果偏高。

2、普通实验室中的空气中常含有少量的氨，会影响结果，所以操作应在单独洁净的房间中进行，并尽可能快地对硼酸吸收液进行滴定。 七、思考题

1、正式测定未知样品前为什么必须测定标准硫酸铵的含氮量及空白？ 2、写出以下各步的化学反应式： ① 蛋白质消化 ② 氨的蒸馏 ③ 氨的滴定

3．指出本测定方法产生的误差的原因。

实验五 氨基酸分离鉴定——纸层析法

一、实验目的

通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理和操作方法。 二、实验原理

纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分离分析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后其一物质在纸层析谱上的位置常用比移值Rf来表示。

纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽提，由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系数，因而在恒定条件（液剂、PH、温度）下，各物质有固定的Rf值，据此可达到分析鉴定的目的。

由于滤纸纤维可吸收20～25%的水分；且其中6～7%以氢键形式与纤维素上羟基结合，一般条件下难脱去；所以纸层析实际上是以水相作固定相，展开的溶剂作流动相。

纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般用上行法。上行法又分单向（成分较为简单的样品）和双向（单向时斑点重叠分离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）。双相层析谱可分辨十几种以上的样品。 层析滤纸要求：

（1）质地均匀，平整无折痕，厚薄适当，溶剂能匀速展开。 （2）机械强度好，溶剂展开后能保持原状，不易折到。 （3）有一定纯度而少杂质，以免影响层析图谱背景。 （4）纤维松紧适宜，一般选用中速滤纸，或根据溶剂选择。如丁醇类粘度大，

宜用快速滤纸；而氯仿、石油醚展开快，宜用慢速滤纸。 层析溶剂要求：

（1）被分离物质在该溶剂系统中Rf在0.05～0.8之间，各组分之Rf值相差

最好能大于0.05，以免斑点重叠。

（2）溶剂系统中任一组分与分离物之间不能起化学反应。

（3）分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达

到平衡，这样所得斑点较圆整。

本实验采用八种混合氨基酸为样品，用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析，以茚三酮为显色剂，可获得分离清晰的层析图谱。 三、试剂和器材

1、试剂

0.1%（W/V）茚三酮溶丙酮液。

溶剂系统：第一相：正丁醇∶88%甲酸∶水＝15∶3∶2（V/V）；

第二相：正丁醇∶吡啶∶95%乙醇∶水＝5∶1∶1∶1（V/V）。 2、测试样品

标准氨基酸混合溶液：亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门

冬氨酸、组氨酸、丝氨酸各100mg溶于50ml 0.01M盐酸中。

3、器材

层析缸25×40cm（×2）；培养皿15cm（×2）；喷雾器；毛细管内径0.1cm；电吹风；烘箱。层析滤纸14×11cm；铅笔，尺。 四、操作方法

1、点样

取层析滤纸一张（14×11cm），在距纸边1.2cm处划一基线；再将纸转90°，距纸边1.2cm处作一线与上线垂直。以毛细管吸取混合氨基酸溶液，点与二线交点处，点的直径控制在2mm左右，不可过大。待样品干燥后再点一次。滤纸上点样斑点干燥后，把滤纸卷成圆筒形，纸的两边以铬丝相连，但不可重叠相碰。

2、展层

在层析缸中平稳的放入装有第一相层析溶剂的培养皿。将圆筒形滤纸放入，点样一段接触溶剂，以点样处不浸入溶剂为准。待溶剂自下而上均匀展开，约2小时后溶剂到达距纸边0.5cm处取出滤纸，悬挂于室温中，以电吹风充分吹尽溶剂。然后裁去未走过溶剂的滤纸边缘，将滤纸转90°，卷成如前圆筒状，放入盛第二相溶剂的层析缸内展开（操作同上），约1小时后溶剂展开到距纸边0.5cm时取出，以电吹风吹尽溶剂使其干燥。

3、显色

以喷雾器将茚三酮均匀地喷在滤纸上，然后悬滤纸于65℃烘箱内加热20分钟，即可看到紫红色氨基酸斑点，将图谱上的斑点用铅笔圈出。 五、注意事项

（1）烘箱加热温度不可过高，且不可有氨的干扰，否则图谱背景会泛红。 （2）第一相溶剂最好在使用前再按比例混合，否则会引起酯化影响层析效果。 （3）接触滤纸时，要戴手套。 六、思考题：

1、什么叫纸层析法？

2、何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？ 3、怎样制备扩展剂？

4、层析缸中平衡溶剂的作用是什么？

5、酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响？

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