实验报告2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 （SDS-PAGE）测定蛋白质的分子量

1 原理

1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理 1.1.1性能

聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。 1.1.2 制备原理

聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。本实验是用化学聚合。化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。

1.1.3 凝胶浓度和交联度与孔径的关系

凝胶浓度根据被分离的物质的分子量大小确定。当分析一个未知样品时，常先用7.5%的标准凝胶或用4~10%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶浓度。凝胶的机械性能、弹性是否适中很重要，胶太软易断裂，；太硬则脆，也易折断。 1.2 SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理

蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于所带净电荷及分子的大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS和巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。

在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。SDS与蛋白质的结合带来两个后果：第一，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使所有的SDS-

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蛋白质复合物在电泳时都以同样的电荷／蛋白质比向正极移动；第二，SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。这两个原因使蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。

选择一系列不同分子量的球形或基本呈球形的蛋白质作为标准物，使其形成SDS复合物。把这些复合物在相同条件下进行电泳分离，分子量小的物质泳动距离大，分子量大的物质泳动距离小。测定出相对泳动率，用相对泳动率对蛋白质的分子量的对数作图，它们在一定范围内呈直线关系。因此可作为标准曲线来检测样品蛋白质的分子量。 1.3 染色原理

常用的染料主要有氨基黑10B、考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝G250、1-苯胺基-8-萘磺酸，各有优缺点，本实验选用考马斯亮蓝R250，它的染色灵敏度比氨基黑高5倍，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。

2 试剂与器材

2.1 试剂

2.1.1 （1号液）凝胶贮备液

丙烯酰胺（Acr） 29.2 g 甲叉双丙烯酰胺（Bis） 0.8 g 加蒸馏水至 100 mL

2.1.2 （2号液）浓缩胶缓冲液（0.5mol／L Tris-HCl 缓冲液，pH 6.8）

三羟甲基氨基甲烷（Tris） 6g 加蒸馏水约50 mL，溶解后以6mol／L HCl调到 pH 6.8， 定容至100 mL

2.1.3 （3号液）分离胶缓冲液（1.5 mol／L Tris-HCl 缓冲液，pH 8.8）

三羟甲基氨基甲烷（Tris） 18.15 g 加蒸馏水 约50 mL 溶解后以6mol／L HCl调到 pH 8.8

加蒸馏水至 100 mL 2.1.4 （4号液）10% 十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液

SDS* （电泳用） 1.0 g 蒸馏水 10.0 mL 2.1.5 （5号液）过硫酸铵（APS）溶液

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过硫酸铵 100 mg 蒸馏水 1.0 mL 临用前配置

2.1.6 （6号液）N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED） 2.1.6 电泳缓冲液

Tris 3 g 甘氨酸 14.4 g 4号液 10ml 加蒸馏水至 1 000 mL 2.1.5 样品缓冲液

2号液 0.5 mL 4号液 4 mL 甘油 2 mL β-巯基乙醇 1 mL 0.04% 溴酚蓝 0.5 mL 加水至10mL 2.1.9 染色剂

考马斯亮蓝R250 0.31g 甲醇 125mL 乙酸 25mL 蒸馏水 100mL 2.1.10 脱色剂

甲醇 250mL 乙酸 50mL 蒸馏水 200mL 2.1.11 保存液 7%乙酸水溶液

2.1.12 SDS-PAGE低分子量标准蛋白质

蛋白质名称 分子量（MW） 兔磷酸化酶B 97400 牛血清白蛋白 66200 兔肌动蛋白 43000

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牛碳酸酐酶 31000 胰蛋白酶抑制剂 20100 鸡蛋清溶菌酶 14400 2.2 器材

电泳仪，垂直板电泳槽，酸度计，电导仪，分析天平，真空泵，高速台式离心机，微量加样器，染色槽，电炉。

3 实验步骤

3.1 制备电泳分离胶

根据样品分子量的大小，配制所需浓度的分离胶。10~100 K分子量的样品，宜采用T=12%的胶，40~200 K分子量的样品宜采用T=7.5%的胶。本实验采用T=10%的胶，具体配方如下：

分离胶：

1号液 10mL 3号液 7.5 mL 4号液 0.3 mL

蒸馏水 12 mL 6号液 18μL 5号液 180μL

按顺序配制，加完6号液后暂时停下来，临用时再加5号液，混匀后立即装入制胶槽，约60 min后就可以凝固。 3.2 制备电泳浓缩胶（T=0.38%）

浓缩胶：

1号液 1.33 mL 2号液 2.5 mL 4号液 0.1mL 蒸馏水 6.1mL 6号液 5μL 5号液 0.1mL

按顺序配制，加完6号液后暂时停下来，临用时再加5号液，混匀后立即装入制胶槽，约30 min后就可以凝固。 3.3 制备凝胶板

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制备凝胶板前先用无水乙醇擦拭玻璃板内面。用2.5%琼脂封边，并用蒸馏水检验是否密封完好。密封好后用吸管缓慢加入分离胶，离顶端约1.5 cm时注入蒸馏水。待界面清晰后，吸去蒸馏水，用吸管吸取配好的浓缩胶冲洗凝固的分离胶面，插入样品槽模板，用吸管缓慢注入浓缩胶。待凝固好后，在玻璃板上用记号笔划出点样槽底线，轻轻拔出样品槽模板。 3.4 样品制备

称取脱盐或冻干的蛋白0.01g，加1mL蒸馏水溶解后，10000rpm离心5min，吸取上清50μL加等体积的样品缓冲液，沸水浴加热3min，取出瞬间离心，上清液备用。

3.5 标准蛋白制备

方法同样品制备，本实验的标准蛋白已经制备好，解冻后直接加样即可。 3.6 加样

用加样器分别取已高速离心过的样品液的上清液5、10、15μL，依次加到三个样品槽的底部。用加样器分别取标准蛋白质10、20μL，依次加到三个样品槽的底部，标准蛋白泳道的两侧各加10μL样品缓冲液作空白对照。并作好记录以免混淆。上好样后缓慢往样品槽中加入电极缓冲液，注意不要有气泡。 3.7 电泳

连接电泳仪的直流电源，正极连在凝胶板的下端，负极连在凝胶板的上端，即有样品的一端。电流值恒为10mA。大约经过4~5 h，样品缓冲液中的溴酚蓝指示剂到达离凝胶底部0.5 cm处，关闭电源，取下电泳板，并将两片玻璃板分开，将凝胶板小心移入染色槽中。 3.8 染色、脱色

加染色剂染色过夜。倾去染色液，加脱色剂将背景的蓝色脱尽，中间要更换数次脱色固定液，然后将凝胶板制成干板、扫描。 3.9 测量相对泳动率Rm值，计算分子量

测量溴酚蓝的泳动距离，将它作为相对泳动率的标准1.0。测量标准分子量蛋白质的泳动距离，算出它们的Rm值（Rm=样品迁移距离／染料迁移距离）。

以分子量的对数值为横坐标，Rm值为纵坐标，将标准分子量蛋白质的坐标点连为一条直线，即得标准曲线。

算出样品蛋白质的Rm值，从标准曲线上查出其分子量的对数值，换算出分子量。

4 实验结果 作出标准曲线及换算样品蛋白质分子量

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