纤维素酶酶活的测定方法

*33*年第"-期中国饲料

—*-—

纤维素酶酶活的测定方法

河南省科学院生物研究所河南省饲料产品质量监督检验站

刘德海陈小鸽

杨玉华

安明理

饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用，对其质量检测显得日益重要。纤维素酶是一种复合酶，按作用底物的能力划分为两部分，一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶，称为!"酶；另一部分是对羧甲基纤维素钠（#$%!&!）起水解作用的酶，称为!’酶。据此，一般采用两种测定方法，一种是适用于!(酶的!&!法，另一种是适用于!"酶的滤纸法。下面就此两种方法作一介绍。

"

!&!（羧甲基纤维素）法")"材料")")"饲用纤维素酶由河南省科学院生物研

究所提供。

")")*试剂磷酸氢二钠、

柠檬酸、羧甲基纤维素、+，,%二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。")")+仪器

-*"型分光光度计、

恒温水浴锅、./0%*酸度计、

秒表。")")1

试剂配制")")1)"2/,)3柠檬酸缓冲液制取3)*45678

磷酸氢二钠液（称取-)"9:磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中，定容至"3348）和3)"45678的柠檬酸液*)":柠檬酸溶解于蒸馏水中，定容至"3348），取磷酸氢二钠液*1)+48、柠檬酸液*,)-48混匀，用精密酸度计测至2/值为,)3。")")1)*羧甲基纤维素溶液准确称取*)3:羧甲基纤维素钠盐溶于*3348水中，沸水浴中加热至溶化，过滤，取滤液"3348，加柠檬酸缓冲液*3

48、

蒸馏水1348，混匀，贮存于冰箱中备用。")")1)++，,%二硝基水杨酸显色液准确称取9)+:+，,%二硝基水杨酸置于*45678氢氧化钠

*9*48溶液中，

然后加酒石酸钾钠的热溶液";*)3:酒石酸钾钠溶于,3348水中），再加,)3

:苯酚和万方数据

,)3:亚硫酸钠，搅拌至溶解，冷却后定容至"33348，贮于棕色瓶中置冰箱中备用。")")1)13)"<标准葡萄糖溶液准确称取经"3,=烘至恒重的无水葡萄糖*,3)3334:，

溶于蒸馏水中，定容至*,348。")*标准曲线的绘制分别吸取3)"<标准葡

萄糖溶液*)3、1)3、9)3、;)3、"3)348，

分别定容至,348。再分别吸取上述溶液各*),48于试管中，各加*),48+，,%二硝基水杨酸，

煮沸,4>?"管对照，取*),48蒸馏水，加*),48+，,

%二硝基水杨酸，

同样煮沸,4>?）。冷却后，用-*"型分光光度计在,+3?4波长下比色，

记录各管的光密度值，以光密度作纵座标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为横座标，绘制标准曲线。")+

测定方法

通过“四分法”精确称取酶样品

*)33:，加温水@348、柠檬酸缓冲液"348，13=浸提"A，以脱脂棉过滤备用。根据酶活高低，上述酶液需适当稀释使其产生的还原糖在"33B,33:之间，光密度在3)"B3)9。取"支小试管（",44C",344），加羧甲基纤维素钠溶液*)348，于,3=水浴中预热*B+4>?，

加稀释酶液3),48，保温+34>?，取出加入+，,%二硝基水杨酸*),48，

沸水浴煮沸,4>?，冷却后用分光光度计,+3?4处比色测定DE值。

另取小试管加羧甲基纤维素钠*)348，先加入*),48+，,%二硝基水杨酸，再加酶液3),48，其他操作同样品测定作空白测定。")1

结果计算

!&!酶活力F

GC?

3),

4:7: +3H ,3=

式中：G—从标准曲线中查得的净葡萄糖毫克数（4:）；?—酶液稀释倍数；3),—测定时吸取稀释酶液毫升数（48）。*滤纸法*)"

材料

（另作!

（称取（

—!E—

中国饲料!..!年第#:期

（$%）、冰醋酸（$%）、甲苯!"#"#试剂醋酸钠

（$%）、氢氧化钠（$%）、酒石酸钾钠（$%）、苯酚（$%）、亚硫酸钠（$%）、（$%）、&，’(二硝基水杨酸新华’号滤纸（剪成#)*+&)*纸条）。!"#"!仪器同,-,法。!"#"&

试剂配制

!"#"&"#."#*/012345"6醋酸—醋酸钠缓冲液准确称取醋酸钠（,4&,7789 &4!7）6":.;和冰醋酸!"6.*2，以蒸馏水溶解，定容至#...*2。其他操作吸取5*2蒸馏水代替5*2酶液，

同样品测定作空白测定。!"5

结果计算滤纸酶活力（BC）D

C+@

!5>5.=*;1;

+#’

式中：——从标准曲线上查得的净葡萄糖C—

5毫克数（*;）；————’*2反@—

’

——吸取#*2酶解液进行应液中含5*2酶液；#—!"#"&"!&，’(二硝基水杨酸显色液配制同

,-,法。!"!

标准曲线绘制

同,-,法。

!"&测定方法酶液制备同,-,法。样品测定方法为：准确吸取5*2酶液和#*2缓冲液于试管中，加入新华’号滤纸条一条，滴入甲苯!<&滴防腐，5.=静止反应!5>。吸取滤纸酶解液#*2，加蒸馏水#"’*2、&，’(二硝基水杨酸溶液

!"’*2于试管中，

沸水浴煮沸’*?@，冷却后在’&.@*处比色测定光密度7A值。

万方数据

测定。&

讨论

作为底物的羧甲基纤维素钠，用不同厂家生产的滤纸测定酶活时，结果不尽相同，有时相差还较大。因此，得出酶活力结论时应注明底物产地。

纤维素酶是一种微生物活性制剂，对温度、酸碱度十分敏感，不同菌株生产的纤维素酶最适34值、最佳作用温度有所不同，测定方法有待进一步探讨。

［通讯地址：郑州市花园路!E号，邮编：

5’...E］

纤维素酶酶活的测定方法

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刘德海， 杨玉华， 安明理， 陈小鸽

刘德海,杨玉华,安明理(河南省科学院生物研究所)， 陈小鸽(河南省饲料产品质量监督检验站)中国饲料CHINA FEED2002(17)65次

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