双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究(2)

在聚合物上引入电荷可以增大两相间的电位差,故可在PEG或葡聚糖上引入带电基团来改变蛋白质的分配。因相间电位差与电荷数成反比,而每个葡聚糖分子上可引入的带电基团较多,故效果较差。相反,每个PEG分子只含两个羟基,只需引入两个荷电基团,电场增大的效果就较好。Johansson等已制得以下四种荷电PEG:带正电的三甲胺基2PEG(TMA2PEG)、氨基2PEG(PEG2NH2)和带负电的PEG2磺酸盐(S2PEG)、羧基2PEG(PEG2COOH)[8]。因此可以根据蛋白质的带电情况来选择荷电PEG,以达到改变蛋白质分配的目的。如红血球蛋白在pH值较小时带正电(等电点为7),若将PEG接上三甲胺基基团后,由于上相带正电,红血球蛋白就不断向下相富集;同理,当pH值较大时,由于受上相正电TMA2PEG的影响,带负电荷的红血球蛋白则开始向上相富集。217 疏水基团

在聚合物上接枝疏水基团后,疏水性成为影响蛋白质分配的主要因素。这种疏水性的影响由连接在高聚物上疏水基的大小和蛋白质分子疏水区域的数量以及疏水区的粘结强度所决定。Shanbhag和Axelsson认为,通过比较蛋白质在PEG2Dextran体系和存在部分P2PEG(Palmitoyl2PEG)的PEG2Dextran体系中的分配系数,可以衡量蛋白质的疏水性。实验表明,在P2PEG浓度很低的情况下,血清白蛋白和乳球蛋白因易于同非极性的P2PEG结合,所以不断向上相富集[8]。218 亲和配基

郑 楠等:双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究/2006年第10期

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(3)金属亲和双水相萃取技术。金属亲和双水相萃取和普通亲和双水相萃取相比,具有亲和配基价廉且再生容易、可用于PEG2盐体系的优点。Arnold提出了金属离子亲和双水相萃取技术,利用金属离子和蛋白质中精氨酸、组氨酸的亲和作用,以达到分离纯化蛋白质的目的。目前金属离子亲和双水相萃取已应用于多种酶的分离纯化。

影响双水相萃取的因素比较复杂,主要包括静电作用、疏水作用及界面张力等。通过对各个因素的调节,可以极大地提高蛋白质的选择性,达到向一相富集的目的。

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在聚合物上接上一定的亲和配基,不仅能提高萃取分配的专一性,而且能增大处理量。例如:NADH2

PEG衍生物引入PEG2Dextran体系后使乙醇脱氢酶的分配系数与其分子上结合位点数密切相关;另Ciba2cronblue2PEG衍生物引入PEG2Dextran体系后使磷酸果糖激酶的分配系数成千倍地提高。也可同时使用以上两种配基,从而增加系统的选择性,完成多种酶的分离和回收[7]。

3 双水相萃取技术在蛋白质分离纯化中的应用和展望

双水相萃取技术已成功地用于分离和提纯蛋白质、提取抗生素和分离生物粒子、电泳分离氨基酸等方面。双水相萃取分离技术还有很多可开拓的领域:

(1)新型双水相体系的开发。新型双水相体系主要有两类:廉价高聚物/高聚物体系及新型功能双水相体系。廉价双水相体系的开发目前主要集中在寻找一些廉价的高聚物取代现用昂贵的高聚物。例如:牌号PPT的变性淀粉和牌号为Reppa/PES的淀粉衍生物以及牌号为Pulluan的微生物多糖等。研究发现由这些聚合物形成的双水相体系的相图与PEG2Dextran形成的双水相体系相图非常相似,其稳定性也比PEG2盐双水相体系更好,并且具有蛋白质溶解度大、粘度小等优点[10]。另外,特别要提到只有一种成相聚合物的新的双水相体系,上相几乎100%是水,聚合物绝大部分集中在下相,该体系不仅操作成本低、萃取效果好,还为蛋白质等生物物质提供了更温和的环境[11]。

(2)后续色谱纯化工艺研究。高聚物/高聚物双水相萃取同离子交换层析技术结合可以解决双水相萃取技术在蛋白质粗分离纯化中的工业化问题。PEG2盐体系具有价廉和分相容易的优点,而疏水色谱可在高盐浓度下操作,故PEG2盐体系与疏水色谱的结合有很大的发展空间。如Schutte已成功利用疏水色谱从盐相中分离纯化蛋白质。

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StudyonPartitionandPurificationofProteinbyAqueousTwo2phaseTechnology

ZHENGNan,LIUJie

(CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,NanchangUniversity,Nanchang330029,China)Abstract:Thefundamentalextractionmechanismofaqueoustwo2phasesystemisexplained.Andthefac2torswhichinfluencepartitionandpurificationofproteinareresearchedindetail.Intheend,Theapplicationandexpectationofaqueoustwo2phasetechnologyinproteinpartitionandpurificationarediscussed.

Keywords:aqueoustwo2phasesystem;protein;partitionandpurification;influencingfactor

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