生化考题

1. 模体与结构域的区别

答：模体（motif）即超二级结构，简言之，就是二级结构有规律的组合。例如螺旋-环-螺旋，贝塔折叠的组合、阿而法螺旋组合等。再比如亮氨酸拉链、锌指结构都是典型的模体，它们执行一定的功能，即模体即是结构的单位，又是功能单位，他们可直接作为结构域和三级结构的建筑块。某些蛋白质因子与DNA大沟结合的 部位靠的就是某些特异的模体。 结构域（domain）是指在较大的蛋白质分子中形成的某些在空间上可以辨别的结构，往往是球状压缩区或纤维状压缩区。它们也既是结构单位，又是功能单位。例如免疫球蛋白的功能区就是结构域。显然模体与结构域是不同的概念。 2. 如何提高大肠杆菌表达天然构像蛋白质的产量 答：增强可溶性和蛋白的正确折叠：

1.为避免包涵体的生成，一切能够降低蛋白质合成速率的条件均适合。温度：建议低温过夜诱导。裂解buffer：可以加入去污剂将与膜粘连的蛋白提出来。定位在周质或者胞质中表达（用有信号肽的载体等，在这种环境中利于形成二硫键，折叠正确）。

2.正确选择宿主菌，比如说一些有稀有密码子的，用origami，或者rosetta。 3.有毒的基因，用petcoco系统不错。

4.还可以好几个target proteins共表达，pet系列有许多商品化的东西。 5.借助于细胞的分子伴侣机制来提高正确折叠的蛋白质的产量。 保证表达蛋白稳定，尽量避免蛋白酶的降解，我们可以通过使用一些蛋白酶缺陷性的表达宿主，其次在表达的过程中可以在培养体系中添加一些蛋白酶抑制剂等来解决。与实现外源蛋白的稳定表达相比，更多时候保证目标蛋白的可溶性表达，是建立表达条件的主要工作。很多外源基因在大肠杆菌表达时很容易形成不可容的包涵体，其原因可能有：表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体；蛋白合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对；过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

改变表达载体下手，像GST，NΜS，MBP, TrxA等融合标签能够提高很多蛋白在大肠杆菌中表达的可溶性，此外一些分泌标签如ompA,Pet-22b上的pelB也能够将目标蛋白运输至细胞的周质空间，从而提高目标蛋白的可溶性。

降低表达速度，可采取低温诱导，如15℃诱导过夜，或者采用弱启动子表达载体。

尝试一些特殊设计的表达宿主Origami：thioredoxin redμctase/glμtathione redμctase 双突变适合带thioredoxin redμctase的融合表达载体，帮助形成更多的二硫键。 对于一些蛋白可能无法实现可溶性表达，这时候溶解包涵体后再纯化是唯一的解决办法。 正确选用合适的载体和宿主菌组合会明显提高目的蛋白可溶部分比例及活性。 选用能将蛋白转运到细胞周质的载体，因为细胞周质的环境更有利于蛋白折叠和二硫键的形成。

3. 血红蛋白氧化时构象变化的要点

答： 血红素中的铁与O2结合时随即进入卟啉环平面内，将邻近的原来倾斜的组氨酸F8拉直，并带动附近肽链的运动，结果导致αβ亚基相对于另一对αβ亚基转动15°角。如果将 4个亚基标记为α1，α2，β1和β2，则α2β2之间和α1间接触面较牢固，没有改变，变动最大的是α1β2（或α2β1）间的接触面，α1β2（α2β1）界面的变动是T态向R态转变的开关（反之亦然）。在T态向R态转变时，盐桥破坏，当O2释放时，又通过该界面的滑动，盐桥重新恢复，R态又能转变成T态。α1β2（α2β1）界面的氨基酸序列是相当保守的，如在这一序列范围内发生突变则对别构效应有较大影响。 4. 血红蛋白氧饱和曲线与功能的关系

答：Hb的氧离曲线呈S形对机体有着重要的生理意义：保证机体各组织对氧的需要

S形曲线上端，PO2从100mmHg降80mmHg，血氧饱和度仅降0.02，这样血液流经肺部时，即使大气中的氧分压有较大变化，也不至于对血氧饱和度产生重大影响，保证Hb和O2有较大程度的结合。

S形曲张中段，PO2由40mmHg降至20mmHg 时，血氧饱和度从0.6降至0.3，这一变动范围恰好相当于组织内PO2的变动范围，故保证了血液流经氧分压较低的组织时，即使PO2有较少的下降，血氧饱和度却有明显的增加，从而释放较多的O2供组织需要。 5. 酵母双杂交的原理

答： 很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。 酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。

6. 蛋白多糖与糖蛋白的区别 糖链含量 糖链组成 糖基排列 与肽链连接方式 分布 生理功能 蛋白多糖 较蛋白质部分多 主要为糖醛酸、糖氨 二糖分子连成长链 一般为O-糖苷键连接，有时可游离存在 主要在细胞外，各种结缔组织基质中 以维持结缔组织的功能为主 糖蛋白 一般少于蛋白质，少数可较多 Glc、Gal、Man、Fuc、GalNAc、GlcNAc、SA，末端常为 SA、Fuc 大多为分支寡糖链 O-糖苷键或N-糖苷键 分布广泛，细胞内外皆有 作用广泛，许多粘蛋白血浆蛋白、膜蛋白等为糖蛋白

7. 糖肽键的种类？

答：蛋白的糖肽连接键，简称糖肽键。糖肽链的类型可以概况为： ① N- 糖苷键型：寡糖链（ GlcNAC 的β - 羟基） 与 Asn 的酰胺基、 N- 未端的 a - 氨基、 Lys 或 Arg 的 W- 氨基相连

② O- 糖苷键型：寡糖链（ GalNAC 的α - 羟基） 与 Ser 、 Thr 和羟基赖氨酸、羟脯氨酸的羟基相连。

③ S- 糖苷键型：以半胱氨酸为连接点的糖肽键。

④ 酯糖苷键型：以天冬氨酸、谷氨酸的游离羧基为连接点。

1. 真核基因组成成分？

答：内含子和外显子、.基因家族和假基因、重复DNA序列

人类结构基因4个区域：①编码区，包括外显子与内含子；②前导区，位于编码区上游，相当于RNA5’末端非编码区（非翻译区）；③尾部区，位于RNA3’编码区下游，相当于末端非编码区（非翻译区）；④调控区，包括启动子和增强子等。基因编码区的两侧也称为侧翼顺序

2. RNA种类、酶？

答：rRNA: 作为核糖体的重要组成成分参与蛋白质的生物合成 tRNA: 转运氨基酸的作用

mRNA: 携带一个或几个基因信息到核糖体的核酸 snRNA: 核内小RNA mRNA加工（剪接和成熟） gRNA: （导引RNA）：mRNA编辑

miRNA: 微小RNA (大约24个核苷酸组成)与基因沉默有关 snoRNA: （核仁小分子RNA）：rRNA加工（切割和修饰） RNA P（RNA聚合酶）：tRNA加工 Telomerase RNA：DNA复制 SRP -RNA（信号识别颗粒）：蛋白质的分泌

Lin-4：发育控制反义RNA（antisence RNA for development control）

rps14：核糖体生物合成反义RNA（antisence RNA for ribosome biogenesis） dsRNA（双链RNA）：基因沉默（gene silence）

Xist (Xi-specific transcript)&其反义RNA Tsix：X染色体失活 端粒 RNA参与 DNA端粒合成并影响细胞的寿命 tmRNA参与破损mRNA蛋白质合成的终止

3. 一级结构测序、PCR原理，同一原理，两种应用.

答：PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

一级结构测定原则：将大化小，逐段分析，先后采用不同的方法制成两套肽片段，找出重叠的片段，排除肽段的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。 1。测定蛋白质中的氨基酸组成。 2。蛋白质N端和C端的测定。

3。应用两种或两种以上的水解方法将索要的蛋白质肽链断裂，各自得到一系列大小不同的肽段。

4。分裂提纯产生的肽，测定他们的序列。

5。从有重叠的各个肽的序列中推断出蛋白质全部氨基酸排列顺序。 4. 蛋白质病毒、结构域…..? 5. 酶生物催化类型？ 答：酸碱催化，共价催化

名词解释：

别构效应（allosteric effect）某种不直接涉及蛋白质活性的物质，结合于蛋白质活性部位以外的其他部位（别构部位），引起蛋白质分子的构象变化，而导致蛋白质活性改变的现象

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