15级硕士研究生《蛋白质组学》试题及参考答案

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13594116299 张雪梅老师

18523323947 周兰老师

7）

交卷时间：2015-12-21

重庆医科大学

2015级学术型硕士研究生《蛋白质组学》试题 学位：医学

姓名 学号 所在院系 1 2 3 4 5 6 7 8 9 平时成绩 1、列举蛋白质组学研究中常用的样品制备技术。简述双向电泳技术的原理及其特点（10分）。

答：（1）激光捕获显微切割技术（LCM）、高丰度蛋白去除技术、自由流电泳技术（FFE） （2）原理：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按

照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。特点：双向电泳分辨率最高：信息量最大；pH梯度稳定；重复性好。

总分 2、如何保证亚细胞蛋白质组学研究中的样品纯度（10分）？

答：细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这

一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步。匀浆，低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质（即0.25mol／L蔗糖-0.003mol／L氯化钙）进行破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。分级分离，由低速到高速离心逐渐沉降。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀

分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。一般从三个方面对亚细胞器的纯度进行评价：1电子显微镜检测2.标志酶活性测定3.Western blot。

3、举例说明药物蛋白质组学在新药研究领域中的应用（10分）。

答：药物蛋白质组学主要应用于：（1）临床前研究-发现所有可能的药物作用靶点，以及针对

这些靶点的全部可能的化合物，以及应用蛋白质组学方法研究药物作用机制和毒理学；（2）临床研究方面-发现药物作用的特异蛋白作为患者选择有效药物的依据和临床诊断的标志物，或以蛋白质谱的差异将患者分类并给予个体化治疗。 举例：药物蛋白质组学在药物靶点发现和确认中的应用

（1）研究人员通过比较给药前后的蛋白质组，找到了药物阿霉素抗乳腺癌的一个作用靶标Hsp27。

（2）疟原虫入侵血红细胞的阻断靶点探测：半胱氨酸蛋白水解酶是疟原虫生存必需的酶，Greenbaum等利用靶向半胱氨酸蛋白水解酶的化学探针I125-DCG-04打靶，然后通过抗DCG-04的生物素纯化，得到了半胱氨酸蛋白水解酶类的亚蛋白质组；通过酶活性分析，最终发现在疟原虫的入侵血红细胞的裂殖期，仅有一个有半胱氨酸蛋白水解酶活性的蛋白质—

falcipain 1；从数据库筛选到falcipain 1的抑制剂YA29-Eps，结果证实YA29-Eps可阻断疟原虫的入侵红细胞。

4、试述免疫共沉淀的原理及其优缺点，并举例说明主要用途（10分）。 答：免疫共沉淀原理：是以抗体-抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的

经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。基本原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能被沉淀下来。该技术可用于鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合以及进行结合位点分析，还可用来筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。

优点：相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。

缺点：1.需要高质量的抗体进行IP；2.两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；3.检测不到弱或瞬时的相互作用。

技术用途：1.鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合，以及进行结合位点分析；2.筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。

5、请比较蛋白印迹技术和免疫组化的异同（10）。

答：免疫组化又称免疫细胞化学，利用抗原抗体特异性反应对组织细胞中的特写抗原（或抗

体）进行定位和定性的一种染色技术。为了显示和观察细胞内抗原抗体反应，需要预先将某种示踪性物质结合到特定的抗体上，借标记示踪物的荧光或酶的有色反应、放射性或高电子密度，在光镜或电镜下进行定性、定量或定位观察。根据显示物质的不同，分为免疫荧光技术、免疫酶技术、亲和组织化学技术和免疫金银技术等，以免疫酶技术最为常用。

免疫印迹又称为Western blot，是先借助凝胶电泳将蛋白质抗原分离，然后将凝胶中的蛋白质转印至膜上，使之成为被分离蛋白的一个拷贝。抗原的位置就可用特异性抗体确定。免疫印迹可以用来检测样品中是否存在蛋白抗原，以及该抗原的含量或该抗原多肽链的相对分子质量等。它还可用于确定蛋白质的酪氨酸残基是否发生了磷酸化。

免疫印迹高效、简便、灵敏。免疫组化呈现的是天然状态的抗原，而免疫印迹使抗原完全变性，并且部分纯化，但需要与固相支持物结合。这也使二者需要不同特性的抗体。免疫组化用于抗原的定位与半定量，但如果需要对抗原表达进行精确定量，还是需要做免疫印迹，更具说服力。

6、质谱仪的组成要件和以MALDI TOF MS获得PMF的分析流程（10分）。 答：（1）质谱仪一般由进样装置、离子化原、质量分析器、离子检测器、数据分析系统组成。

（2）MALDI-TOF-MS分析肽混合物时，能耐受适量的缓冲剂、盐，而且各个肽片几乎都只产生单电荷离子，因此MALDI-TOF成为进行分析PMF的首选方法。

1.将待测样品与基质混合并置于样品板上干燥。2.将样品板放入质谱仪的样品。3.样品点被激光脉冲照射，解吸，离子化。4.离子被电场加速，进入真空漂移管5.离子的m/z不同，飞行时间不同，先后到达检测器。6将分离得到的结果，与数据库对比，得到肽质量指纹谱后，再在数据库中查询鉴定蛋白质。

7、谈谈血浆蛋白质组学研究中需要着重注意的问题以及目前多维策略的研究进展（10分）。

答：1、血浆/血清样品选择

①去血小板的血浆由于避免血小板的激活作用，减少了蛋白质的体外降解，因而较血清更适合一定的肽组学研究；②去血小板的EDTA血浆或枸橼酸血浆样品，更适合分析低分子质量的蛋

白质；③如果要使用一定的蛋白酶抑制剂，一定要在早期加入，而且要谨慎使用，因为抑制剂的加入可能对MS分析造成一定的干扰，而且一些小分子的抑制剂与蛋白质结合转化成蛋白质的亚型，这些都将使得分析结果变得复杂。 2、样品的收集与贮存

①为减少血小板的污染，血液样品在分析前最好用0.2μm的低蛋白质结合膜过滤，样品分装冰冻储存，减少融化-再冰冻的循环；②样品应分装并贮存在液氮中，减少或不加蛋白酶抑制剂，以减少对测定结果的干扰。 3、去除高丰度蛋白和分级技术

血浆/血清样品中蛋白质种类很多，而且所含蛋白质具有较大的动力学范围，其中有许多丰度较高但不含有特殊生物学信息的蛋白质，这将会对目标蛋白质的分析造成极大的困难，甚至根本不能检测低丰度蛋白质，因此，通过对原始蛋白质进行洗脱和分步分离减少样品中蛋白质的复杂性，可以极大简化蛋白质的预测和分析，提高对低丰度蛋白质的检测和识别的灵敏度和准确度。

4、多维策略的运用：联合使用不同技术平台并加以适当改进是目前最通用的手段：主要包括：去除高丰度蛋白、样本预分离系统、分离系统、质谱鉴定系统

8、试述临床肿瘤蛋白质组学研究的标本及其特点（10分）。

答：1）组织细胞标本如手术切除和穿刺活检组织：组织细胞新鲜，组织形态保存好，可协助

临床对病变作出诊断或为疾病诊断提供线索。了解病变性质、发展趋势，判断疾病的预后。验证及观察药物疗效，为临床用药提供参考依据。发现新的疾病或新的类型，为临床科研提供病理组织学依据。

2) 福尔马林固定-石蜡包埋组织：组织形态保存好，穿透性强，组织收缩少，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；石蜡块还能长期存档，供回顾研究。

3）各种体液：（1）乳头溢液、痰液、泪液等 （2）尿液（3）各种消化液（胰液、胃液、唾液等）（4）脑脊液、关节腔液（5）血液***液体活检（6）肿瘤间质液：对外周血中游离DNA和循环肿瘤细胞及其中的核酸和蛋白质等进行全面分析，以避免侵入性的活检；取样患者肿瘤的全部片段，可以评估肿瘤的异质性。反映出肿瘤的大致轮廓，包括当时患者肿瘤的所有突变 、甚至癌细胞扩散的方式和路径。

9、结合自己专业，简述应用蛋白质组学方法寻找疾病标志物的程序（步骤）及相应技术（10分）。

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