高中生物奥林匹克竞赛辅导专题讲座 - 专题九 - DNA技术与人类基

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高中生物奥林匹克竞赛辅导专题讲座 专题九 DNA技术与人类基因组

【竞赛要求】

1． DNA操作的工具 2． 质粒是基因的载体 3． 内切酶与连接酶 4． 基因克隆 5． 反转录 6． DNA探针 7． PCR技术 8． 人类基因组

9． DNA技术的应用

10．DNA技术带来的危害与伦理问题

【知识梳理】

一、基因工程概述

基因工程：是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。一般来说，基因工程是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质--DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中\安家落户\，进行正常复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。

这个定义表明，基因工程具有以下几个重要特征：首先，外源核酸分子在不同的寄主生物中进行繁殖，能够跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因放置到新的生物中，而这种生物可以与原来生物毫无亲缘关系，这种能力是基因工程的第一个重要特征。第二个特征是，一种确定的DNA小片段在新的寄主细胞中进行扩增，这样实现很少量DNA样品\拷贝\出大量的DNA，而且是大量没有污染任何其它DNA序列的、绝对纯净的DNA分子群体。

二、细胞是DNA操作必不可少的工具 （一）质粒是基因的载体

基因载体或称克隆载体。这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁

殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。

细菌质粒是独立于细菌拟核中DNA分子的自主复制的环状双链DNA分子，是基因工程最常用的运载体。最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。大肠杆菌的质粒中常含有抗药基因，如抗四环素的标记基因。细菌质粒的大小只有普通细菌拟核DNA的百分之一左右。质粒能够“友好”地“借居”在宿主细胞中。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。但是，质粒的复制则只能在宿主细胞内完成。土壤农杆菌的质粒常用于培育转基

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因植物。 （二）工具酶

1．限制性内切酶：识别特异序列，切割DNA

2．DNA连接酶：催化DNA中相邻的5′磷酸基与3′羟基间形成磷酸二酯键，使DNA切口

封合，连接DNA片段 3．DNA聚合酶Ⅰ：

（1）合成双链cDNA中第二条链? （2）缺口平移制做探针? （3）DNA序列分析? （4）填补3′末端

4．Taq酶 : 催化PCR反应，聚合DNA

5．反转录酶: a.合成cDNA。b.替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补，标记或DNA序列分析 6．多聚核苷酸激酶: 催化DNA 5′羟基末端磷酸化，或标记探针 7．碱性磷酸酶: 切除DNA5′末端磷酸基

8．末端转移酶: 在3′羟基末端进行同系多聚核苷酸加尾 9．DNA酶: 切割DNA 10．RNA酶: 切割RNA

在所有工具酶中，限制性核酸内切酶具有特别重要的意义。所谓限制性核酸内切酶就是识别 DNA的特异序列，并在识别点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。根据酶的组成，所需因子及裂解DNA方式的不同，可将限制性核酸内切酶分为三类。重组DNA技术中常用的限制性核酸内切酶为Ⅱ类酶，大部分Ⅱ类酶识别DNA位点的核苷酸序列呈二元旋转对称，通常称这种特殊的结构顺序为回文结构。 下面小结限制性内切酶

Ⅰ类 需 Mg 2+、SAM及ATP Ⅱ类 仅需 Mg 2+ Ⅲ类 需 Mg 2+及ATP 识别位点复杂，特异性差，切割位点距识别点远。 识别切割特异性强，切割发生在识别位点。 切割位点在识别位点周围，酶活性不单一。 （三）基因克隆

1．概念：DNA克隆就是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合

成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。 2．重组 DNA的基本原理

一个完整的DNA克隆过程应包括：①目的基因的获取，②基因载体的选择与构建，③目的基因与载体的拼接，④重组DNA分子导入受体细胞，⑤筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）。 （1）目的基因的获取

目前获取目的基因大致有如下几种途径或来源。

a．化学合成法：如果已知某基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出该多肽编码基因的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 b．基因组DNA：采用物理方法(剪切或超声波)或限制性内切酶将染色体DNA切割成许多片段，然后将它们与适当克隆载体结合，将重组DNA转入受体菌中扩增，每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就涵盖了基因组全部信息，即基因文库。建立基因文库后，结合适当筛选方法从众多的转化子菌株中选出含某一基因的菌株，扩增分离得到目的基因。

c． cDNA：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双

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链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增为cDNA文库。用适当方法cDNA文库中就可以筛选分离到目的基因。

d．聚合酶链反应：在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合成，使目的基因按指数增长。 （2）克隆载体的选择与改建

a.质粒：存在于细菌染色体外，小型闭合环状双链DNA分子，可独立自主进行复制，含筛选标记，含多种限制性内切酶的单一切割位点，可插入目的基因。 b.噬菌体：eg λ噬菌体、MB载体

c.柯斯质粒与酵母人工染色体载体：用于插入大DNA片段。 d.病毒载体。

（3）外源基因与载体的连接

即DNA的体外重组。这种DNA重组是靠DNA酶将外源DNA与载体共价连接的。 a．粘性末端连接

Ⅰ.同一限制酶切割位点连接 由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。那么，当这样的两个DNA片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。

Ⅱ.不同限制酶切割位点连接 由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，具有相同类型的粘性末端，即配对末端，也可以进行粘性不同末端连接。 b．平端连接

c．同聚物加尾连接

同聚物加连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移酶作用下，在DNA片段制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。 d．人工接头连接

（4）重组 DNA导入受体细胞

根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化、转染和感染等不同手段。

a.感受态细胞。经一定方法处理(如CaCl 2处理)后具备接受外界DNA能力的大肠杆菌。受体菌应为安全无毒菌株，且为限制酶缺陷型及重组缺陷型。

b.转化、转染及感染。本定义不涉及真核细胞，只针对大肠杆菌。 转化：以质粒为载体，将携带外源基因的载体 DNA导入受体细胞。

转染：以噬菌体为载体，用 DNA连接酶使噬菌体DNA环化，再通过质粒转化方式导入受体菌。

感染：以噬菌体为载体，在体外将噬菌体 DNA包装成病毒颗粒，使其感染受体菌。 （5）重组体的筛选 a．直接选择法

直接法是针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法，其特点是直接测定基因表型。

Ⅰ.抗药性标志选择：如果克隆载体携带有某种抗药性标志基因，则只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌药物的培养板上幸存并形成菌落。

Ⅱ.标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么就可以利用营养突变菌株进行筛选，这就是标志补救筛选。 Ⅲ.分子杂交法 b．免疫学方法

应用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选，属非直接选择法。特异性强、灵

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敏度高，适用于选择不为宿主菌提供任何标志的基因。 （6）克隆基因的表达 a．原核表达体系

大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系，运用大肠杆菌表达载体符合下述标准：①含大肠杆菌适宜的选择标志②具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子③含适当的翻译控制序列和翻译起始点等④含有合理设计的多接头克隆位点，以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。

大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处：①由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA；②由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰；③表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理；④很难表达大量的可溶性蛋白。 b．真核表达体系

与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优势性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达真核的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA；将表达载体导入真核细胞的过程称转染，常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导转染、电穿孔法、脂质体转染及显微注射。

三．DNA操作技术的其他工具 （一）反转录

1970年Temin等在致癌RNA病毒中发现了一种特殊的DNA聚合酶，该酶以RNA为核板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序(其中V与A配对)合成DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为反转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做反转录酶。后来发现反转录酶不仅普遍存在于RNA病毒中，哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有反转录酶。

反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3′桹H末端上，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA, cDNA)，它与RNA模板形成RNA桪NA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程(如下图)。

携带反转录酶的病毒又称为反转录病毒，它侵入宿主细胞后先以病毒RNA为模板靠反转录酶催化合成DNA，随后这种DNA环化并整合到宿主细胞的染色体DNA中去，以原病毒的形式在宿主细胞中一代代传递下去。以后又发现许多反转录病毒基因组中都含有癌基因，如果由于某种因素激活了癌基因就可使宿主细胞转化为癌细胞。 大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性：

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① DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为

引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。

② RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNa

se H从RNA5′端水解掉RNA分子。

③ DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为

底物，再合成第二条DNA分子。除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。 （二）DNA探针

DNA探针技术又称分子杂交技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。DNA探针是利用同位素、生物素等标记的特定DNA片断，该片断可大至寄生虫基因组DNA，小至20个碱基。当DNA探针与待测的非标记单链DNA（或RNA）按碱基顺序互补结合时，以氢健将2条单链连接而形成标记DNA-DNA（或标记DNA-RNA）的双链杂交分子。将未配对结合的核苷酸溶解后用检测系统（放射自显影或酶检测等）检测杂交反应结果。由于DNA分子碱基互补的精确性，单连DNA探针仅与样品中变性处理的DNA单链出现配对杂交，由此决定了探针的特异性；用放射性同位素（如32P）或生物素标记探针，使杂交试验同时具有高度的敏感性。 相关内容：

所谓杂交指两个以上的分子因具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体，杂交体中的分子不是来自一个二聚体分子。同一个二聚体中的两个分子在变性解离后重组合称为复性。利用两条不同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链叫核酸杂交。与核酸杂交技术相对应的另一项技术被称为探针技术，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术，我们把标记的分子叫探针。将探针技术与分子杂交技术相结合，从而使分子杂交技术得以广泛推广应用。目前所用的核酸杂交技术均应用了标记技术。

DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获的DNA探针种类很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类ALU探针，这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比用G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向，加之分子杂交技术的高度敏感性，分子杂交在临床性病病原体诊断上具有广泛的前景。

DNA探针（包括cDNA探针）有三大优点：第一，这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。其次，DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。第三，DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。

（三）PCR技术

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，

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