EGFP在肿瘤细胞中的表达调控（基因工程综合性实验）(2)

EDTA(pH8.0)定容至1000mL。

7) 1×TAE的配制

将配置好的50×TAE稀释50倍即得到1×TAE

６ 感受态大肠秆菌的制备

① 保存于-70℃的大肠杆菌菌株DH5a、stab3及ER2925用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现（约14-16 hr）。

② 挑取单菌落，接种于2.0mL LB液体培养基中，37℃恒温，250g振荡培养过夜（约12hr）。

③ 取0.5mL 过夜培养液，接种于100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2hr。

（注：以下操作均应在冰浴中进行。）

④ 将培养液分入两个50mL离心管中，4℃，离心10min（4000rpm），弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25mL悬浮30min。

⑤ 4℃离心, 离心10min（4000rpm），弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1mL悬浮。

⑥ 以100μL/管分装入1.5mL离心管中，-70℃冻存备用。

2.2.9质粒的转化

① 取2管（100μL）贮存于-70℃DH5α感受态ER2925大肠杆菌置于冰上待用；

② 分别加入pLenti6/V5-D-TOPO和pUC57-ModhTERT、pUC57-WThTERT（0.5μg/μL）质粒5μL，旋转混匀，冰浴20min；

③ 迅速放入42℃水浴锅中热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；

④ 加入LB液体培养基600μL，于37℃缓摇孵育90min；

⑤ 培养结束后，12000rpm离心15秒，倾去上清，保留100μL左右的菌液； ⑥ 将100μL的菌液涂布于含有氯霉素(34μg/m1)抗性的平板LB培养基中,于37℃温箱孵育至胶表面没有液体流动时（约2hr），然后翻转平皿37℃倒置培养16hr。

2.2.10 质粒扩增提取

将转化质粒菌株于LB固体培养基上划线，37℃培养16h左右产生克隆后，

挑单菌落扩增并重新提取质粒：

①从接种了抗性质粒的培养基中挑选一生长良好的单菌落，小心用无菌牙签挑出，接种至含抗生素的5ml LB液体培养基的试管中，37℃，200r/min振摇过夜。次日取菌液1.5毫升转入1.5毫升的离心管中，5000 g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复2次，每个1.5毫升离心管共收集4.5毫升过夜菌沉淀。

②每管加入250微升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。每管加入250微升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌完全裂解，溶液透明。每管加入350微升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。冰浴2分钟。

③最高速(13,000rpm左右)室温离心10分钟。将上一步骤离心后的上清吸入到质粒纯化柱内。最高速离心30-60秒，倒弃收集管内液体。

④在质粒纯化柱内加入750微升溶液IV，最高速离心30-60秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体。再最高速离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。

⑤将质粒纯化柱置于1.5毫升离心管上，加入50微升溶液V至管内柱面上，放置1分钟。最高速离心1分钟，所得液体即为高纯度质粒。

6

修饰型hTERT启动子设计与合成

如图2.1示，野生型hTERT（WThTERT）启动子序列取自GENE BANK中序列

号为AF098956所记载在hTERT起始子ATG上游序列（-10,-268bp）片段，修饰

hTERT(Mod1hTERT)启动子序列是在野生型hTERT启动子的3'端接入含有3个E-box重复序列（5'-CTCGAGGACGCACGTGGGCGCACGTGGGCGCACGTG-3'）而形成，两种hTERT启动子片断用化学法进行合成,并亚克隆入质粒PUC57中，新得到质粒被命名为PUC-WThTERT和PUC-Mod1hTERT。

图 2.1 野生型hTERT启动子与修饰hTERT启动子结构示意图: -268至-10之间的序列为野生型hTERT启

动子序列；修饰型hTERT启动子由野生型hTERT启动子和一个含有3个E-box的插入序列连接而成；-9至

-1以及ATG不属于启动子的组成部分。

Fig.2.1 Sequence and construction of WThTERT promoter and Mod1hTERT promoter: the fragment from -268 to -10 is the sequence of WThTERT promoter; Insert containing the extra 3 of E-boxes; Mod1hTERT promoter sequence was composed by both WThTERT promoter sequence and insert. Fragments from -9 to -1 and ATG are out of the composition of Mod1hTERT promoter sequence

７ 分子克隆：从质粒 pEGFP-N3 中通过PCR扩增EGFP编码基因

引物设计：

上游引物P1：5′-AGAACTAGTAGGCGTGTACGGTGGGA-3′

下游引物P2：5′-TACACGAGCCCTATCTCGGTCTATTCTT-3′ 按以下反应体系进行：

模板 (50 ng/pl) 1μL 上、下游引物各 (15pmol/ul) 1μL dNTP (25 mmol/L ) 2μL Taq DNA 聚合酶 (5U/ul) 0.5μL Taq 缓冲液 2.5μL 加无菌双蒸水 至25μL 在 PCR 扩增仪上扩增，反应条件如下：

预变性 96℃ 3min，变性94℃ 45s，退火52℃ 30s，延伸72℃ 120s，

共30循环。

目的DNA片段的回收实验步骤如步骤同上。

８ 载体构建

pLenti6/V5-D-TOPO-EGFP:

１） 将上述ＰＣＲ操作所得的EGFP片段与线性pLenti6/V5-D-TOPO载体（按

１０：１分子数）共同转入感受态大肠杆菌stab3中，方法同上。

２） 回收质粒后进行双酶切鉴定，新得到的质粒命名为

pLenti6/V5-D-TOPO-EGFP。

plenti-WThTERT:

１） 将质粒puc57-Mod1hTERT及pLenti6/V5-D-TOPO-EGFP转入甲基化酶(dcm)

阴性的菌株ER2925(新基因公司)大肠杆菌中进行扩增并回收质粒. ２） 用限制性内切酶claI和BamHI对质粒puc57-Mod1hTERT及

pLenti6/V5-D-TOPO进行过夜消化.

３） 凝胶电泳分别回收claI和BamHI消化质粒pLenti6/V5-D-TOPO-EGFP(无启

动子)及Mod1hTERT启动子片段。

４） 用T4 DNA连接酶将Mod1hTERT启动子片段与pLenti6/V5-D-TOPO(无启动子)

片段（分子数２０：１）进行连接反应，得到的质粒命名为：plenti-Mod1hTERT.

９ 细胞培养

将293T细胞分别接种于内含10%胎牛血清（购于Hyclone）、100μg/ml链霉毒（购于Hyclone）、100μm/ml青霉毒（购于Hyclone）的DMEM培养基中（购于Hyclone）、于12孔细胞培养板中, 转入CO2培养箱中37℃进行培养，待细胞生长融合至40%～60%时，进行质粒转染。

１０ 脂质体介导细胞转染

①转染前细胞的处理：

转染前，选取形态好，活力强的培养细胞，细胞计数，用培养液调整细胞悬液的浓度至2×105/mL并接种于24孔培养板。然后置于37℃，5à2，饱和湿度培养箱中培养。待其密度生长至80%－90%时，改用无血清和无抗生素培养基培养。

② 脂质体-质粒DNA 的准备：

在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) ：

A液：用不含血清培养基稀释1-10μg 的plenti-WThTERT-EGFP和plenti-ModhTERT –EGFP质粒DNA，终量100μl 。

B液：用不含血清培养基稀释2-50μg 阳离子脂质体，终量100μl 。 ③ 转染准备：

用2mL不含血清的培养液漂洗细胞两次，再加入1mL不含血清培养液。

④ 转染：

把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

⑤ 转染48h后用荧光显微镜观察报告基因EGFP的表达。

１１EGFP表达的激光共聚焦显微镜观察

将plenti-WThTERT-EGFP和plenti-ModhTERT -EGFP质粒载体，在阳离子脂质体介导下，分别转染上述细胞(具体操作详见阳离子脂质体使用说明书).37℃、5% CO2中培养48h后，用激光共聚焦显微镜下观察感染结果.

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