生物化学实验2014.9modify(3)

农信１３０１ 黄海 （1）样液的配制

称取兰色葡聚糖2000 2.5毫克，铬酸钾1.5毫克，溶于0.5毫升洗脱剂中。 （2）加样

用滴管吸去凝胶床顶部大部分液体，稍稍打开出口使洗脱剂恰流到与床表面一致（不能露出床面），关闭出口，小心地用吸量管把0.4ml上述混合样品贴近床面沿着柱内壁轻轻地慢慢加入。注意，切勿搅动床表面！打开出口，使样品液渗入凝胶内（不能使床面露出），同时开始收集计量，然后用0.5~1毫升洗脱剂沿柱内壁洗凝胶床面二次，尽量做到不稀释样品液同时又使样品液均匀渗入凝胶，当液面至床表面时，小心加入洗脱剂2~3cm高。

4．洗脱与收集

调节洗脱液流速0.3毫升/分。仔细观察样品在色谱柱内的分离现象，收集并量取洗脱流出液体积，当达到4毫升时，开始用刻度离心管每隔1.5毫升收集一管，目测并以－、＋＋、＋＋＋符号记录两种物质洗脱流出液的颜色深浅程度。

5．绘制洗脱曲线

以洗脱管数为横坐标，洗脱液的颜色强度（－、＋、＋＋、＋＋＋）为纵坐标（相对指示出洗脱流出液内物质浓度变化），在坐标纸上作图，即得洗脱曲线。

洗脱曲线

五、思考题

1．什么叫“分子筛”效应，本实验的分子筛作用与盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子筛作用有什么不同？

2．葡聚糖凝胶标号大小与凝胶交联度大小、吸水量大小、凝胶的“网眼”大小及适宜分离的物质分子量大小有何关系？

3．凝胶装柱时，水和胶的比例要适当，加胶最好一次完成。若几次加胶可能会产生不良的影响，如何避免这一不良影响？

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实验五 蛋白质浓度测定

考马斯亮蓝显色法

一、目的和要求

1、学习和掌握考马斯亮蓝显色法测定蛋白质浓度的原理和操作方法。 2、进一步熟悉和掌握721分光光度计使用方法。

二、基本原理

考马斯亮蓝显色法是Bradford于1976年建立起来的一种蛋白质浓度的测定方法。因此又称为Bradford方法，该方法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250定量结合。当考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从465nm变为595nm。在考马斯亮蓝G-250过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250从吸收峰为465nm的形式转变成吸收峰为595nm的形式，而且这种转变有一定的数量关系。一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250显色法来测定溶液中蛋白质的含量。长期以来，人们一直习惯用Lowry法来测定蛋白质浓度，但近年来，越来越多的人开始用考马斯亮蓝G-250显色法来测定蛋白质浓度，与Lowry法相比，该方法具有下列优点：①方法简单，只需一种显色液。②反应迅速，只需一步反应，显色可在5 min之内完成。③干扰少，许多被认为对Lorwy法有干扰的物质（如糖、缓冲液、还原剂和络合剂）不影响该方法。尽管该方法有如此多的优点，但在实际应用中也有其缺点，如线性关系不很好，因此使用该方法测定蛋白质浓度时应特别注意。

三、实验器材与试剂

（一）、实验器材

1、试管：15×1.5cm 13支

2、移液管：0.5ml 1支 1ml 3支 5ml 1支 3、721分光光度计

（二）、试剂及其配制

1、标准蛋白质溶液：牛血清白蛋白溶解于蒸馏水，配成浓度为250mg/L。 2、考马斯亮蓝显色液的配制：0.12克考马斯亮蓝G-250溶解在100 ml 95%的乙醇中，加少量蒸馏水后加100ml 85%的磷酸，然后用蒸馏水定容至1升，即为显色液。

四、操作步骤

1、标准曲线的制作

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农信１３０１ 黄海 取6支洁净干燥的试管按下表顺加入试剂

试管中的蛋加入标准蛋考马斯亮

加入H2O

Abs595nm 管号 白质总量白溶液的量蓝显色液

的量（ml）

(ml) (ml) (μg)

1 1.0 0 0 5 2 0.8 0.2 50 5 3 0.6 0.4 100 5 4 0.4 0.6 150 5 5 0.2 0.8 200 5 6 0 1.0 250 5

所有试剂加入后混匀，可立即在721分光光度计上测定595nm处的吸光度（Abs595nm），以蛋白质浓度为横座标，Abs595nm为纵座标作图制作标准曲线。

2、样品测定

在做标准曲线的同时，取另一支试管加入1ml待测样品，然后加入5ml考马斯亮蓝显色液，混匀后测定Abs595nm。由Abs595nm值从标准曲线中查出待测样品中的蛋白质浓度。为了提高待测样品结果的准确性，可同时对待测样品做一重复。

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实验六 液化型淀粉酶活力的测定

一、目的

熟悉并掌握测定液化型淀粉酶活力的原理和方法。

二、原理

液化型淀粉酶（即α－淀粉酶）能催化淀粉水解成小分子的糊精和少量麦芽糖和葡萄糖。本实验以碘的呈色来测定水解作用的速度，从而衡量酶活力的大小。

三、试剂与器材

（一）试剂

1、原碘液：称取碘液11克，碘化钾22克，加入少量水，使碘完全溶解后，定容至500毫升，藏于棕色瓶内。

2、稀碘液：取原碘2ml，加碘化钾20克，用水溶解并定容至500ml，藏于棕色瓶中。

3、2%可溶性淀粉溶液：精确称取可溶性淀粉2.0克（以绝干计）。用10ml水调匀，倾入90ml水中，再加热煮沸2－3分钟，使溶液透明为止，冷却后定容至100ml，此溶液需新鲜配制。

4、0.02M柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液（pH＝6.0）：称取柠檬酸（C6H8O7?2H2O）8.07克，磷酸氢二钠（Na2HO4?12H2O）45.23克，加水溶解至100ml，配制后用pH计校正到pH=6.0.

5、标准“终点色”溶液

（1）精确称取氯化钴（CoCl2?6H2O）40.2439克，重铬酸钾0.4878克，加水溶解并定容至500ml。

（2）0.04%铬黑T溶液：精确称取铬黑T（C20H12N3NaO7）40mg，加水溶解并定容至100ml。

取（1）液40ml与（2）液5.0ml混合，即为标准“终点色”溶液，此液宜冰箱保存，有效期为15天。

（二）器材

1、调色板（白色） 1块 2、试管2.5×25cm 1支 3、恒温水浴箱 1只 4、烧杯100ml 1只 5、容量瓶 1只 6、漏斗 1只 7、移液管20ml、5ml、0.5ml 各1支

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四、操作

1、待测酶液的制备

精确称取酶粉1.0000-2.0000克。加入小烧杯内，先用少量40℃ 0.02M pH6.0柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲溶液溶解，并用玻棒捣研，将上清液倾入容量瓶内（容量瓶大小根据酶粉活力单位数商定稀释倍数后选择），沉渣部分再加入少量上述缓冲液，如此反复捣研3－4次，最后全部移入容量瓶中，用上述缓冲液定容至刻度，摇匀，用四层纱布（或滤纸）过滤，滤液即为待测之酶液。

如为液体样品，可直接过滤，吸取一定量滤液于容量瓶中，加上述缓冲液稀释到刻度，摇匀，备用。

2、测定

（1）取标准“终点色“溶液2ml，滴于调色板空穴内，作为比较终点颜色的标准。

（2）吸取2%可溶性20ml及pH6.0 0.2M柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液5ml，置于大试管中，在60℃恒温水浴中预热4－5分钟，然后加入待测之酶液0.5ml，立即记录时间，充分摇匀，定时用滴管从试管中取出反应液约0.5ml，滴于预先盛有稀碘液（约1.5ml）的调色板空穴内，当穴内呈色反应由紫色逐渐变红棕色，直至与标准“终点色“相同是，即为反应终点，并记录时间T（分钟）。

五、计算

在60℃pH6.0的条件下，1小时液化1克可溶性淀粉的酶量为1个酶（活力）单位，酶活力用1克酶粉或1毫升酶液于60℃pH6.0条件下，1小时液化可溶性淀粉的克数也就是酶单位数来表示。

酶活力＝（60?20?2%?n)?0.5(酶单位/克酶粉） T式中：T为反应时间（分） 60为60分钟

20×2%为可溶性淀粉的量（克） n为稀释倍数

0.5为吸取待测酶液的量

六、注意

1、酶反应时间应控制在2－2.5分钟内，否则应改变稀释倍数重新测定。 2、本实验中，吸取2%可溶性淀粉及酶的量必须准确，否则误差较大。

七、思考题

本实验中，为了使测得的酶活力准确，哪些实验数据必须非常准确，为什么？

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