生物化学实验2014.9modify(2)

农信１３０１ 黄海

实验三 蛋白质的等电点测定

一、目的

初步学会测定蛋白质等电点的方法。

二、原理

蛋白质是由氨基酸所组成的，虽然绝大多数氨基酸的氨基与羧基已结合成为肽键，但是，总有一定数量的自由氨基与自由羧基，以及酚基、巯基、胍基和咪唑基等酸碱基团。因此，蛋白质和氨基酸一样，是两性电解质，具有两性反应。调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷与负电荷相等，以兼性离子状态

COO- P + NH3 存在。在电场中，该蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值，称为该蛋白质的等电点（以pI表示）。

COO-Pr NH2 H+ COO-OH-Pr NH3+ H+OH- COOHPr NH3+阴离子 兼性离子 阳离子 pH>pI pH=pI pH

在等电点时，蛋白质溶解度最小（为什么？）容易沉淀析出。

若配制体积相等的一系列不同pH值的缓冲溶液，在其中各加入等量的某蛋白质溶液，混匀后静置一段时间，观察并比较各管的混浊度，可知最混浊的那个试管中溶液pH即是该蛋白质的等电点。

三、实验试剂与器材

（一）试剂：

1、0.5%酪蛋白的醋酸钠溶液，取纯酪蛋白0.25g置于50ml容量瓶中，加水约

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20ml及1 mol·L1 NaOH 5ml，待酪蛋白完全溶解后，加入1 mol·L1醋酸5ml，

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用水稀释到50ml，混匀，或将酪蛋白溶于0.1 mol·L1 NaAc溶液中。

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2、0.10 mol·L1 HAc

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农信１３０１ 黄海 3、0.01 mol·L1 HAc

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4、1.00 mol·L1 HAc

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（二）器材：

1、试管 2、试管架

3、移液管1ml 2ml 5ml

四、操作步骤

1、取直径相似的干燥试管5支，按下表准确加入各种试剂： 1 2 3 4 5 试 管 编 号 加蒸馏水 2.4 - 3.0 1.5 3.4 －1入1.00 mol·L HAc 1.6 - - - - －1试0.10 mol·L HAc 4.0 1.0 －1剂 0.01 mol·L HAc 2.5 0.6 (ml) 酪蛋白醋酸钠溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 3.5 4.1 4.7 5.3 5.9 溶液最终pH 混浊度

加毕摇匀，即配成不同氢离子浓度的缓冲液，各管内溶液的pH如表中所示。 静置约30分钟，观察各试管溶液的混浊度，以—、+、++、+++表示之。

注：该实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确，实验中应严格按照定量分析的要求和操作进行。

根据实验观察结果，指出酪蛋白达到其等电点时溶液的pH值，并说明其原因。

五、思考题

1、在蛋白质两性反应及酪蛋白等电点测定这两个实验中所用的酪蛋白溶液是不同的，它们有何区别？能否将它们对调使用？为什么？

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实验四 葡聚糖凝胶色谱

一、目的要求

掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶色谱的原理和方法。

二、原理

凝胶色谱是以被分离物质的分子量差异为基础的一种色谱方法。这种色谱的固定相是具有多孔、网状结构的颗粒状凝胶所吸附的液体，不同型号的色谱凝胶，其网孔的大小是不同的。能分离的物质量范围也就不同，色谱时一般根据欲分离物质的大小及工作目的来选择一定孔径的凝胶装柱，于柱上端加待分离的混合物，然后用蒸馏水或其他稀溶液（即流动相，也叫洗脱剂）洗柱时，由于各物质分子大小和形状不一而得到分离，大分子物质先随洗脱剂流出柱，小分子物质最后流出色谱柱。关于凝胶色谱的机理有许多假说和理论，目前为人们普通接受的理论是分子筛效应，如下图所示：

凝胶色谱的简单原理

甲：待分离的混合液上柱，于色谱床表面，（○代表大分子物质，·代表小分子物质，?代表凝胶。）

乙：当样品随溶剂沿色谱床往下移动时，大分子物质因位阻效应，随溶剂流动，而小分子物质渗入凝胶颗粒内。

丙：大分子物质行程短，已流出色谱床，小分子物质尚在行进中。

由上图可以清楚地看出，分子量大的物质不能进入凝胶的网孔；完全被排阻在凝胶颗粒之外而随洗脱液在凝胶颗粒之间流动，因此，流程短，移动速度快，最先流出色谱柱，分子量小的物质可自由进入网孔而渗入到凝胶颗粒内部，因此，流程长，移动速度慢，最后多色谱柱中流出，而分子大小介于上述二者之间的各物质都能不同程度地渗入凝胶颗粒，因此，它们在二者之间依次流出色谱法，由此就达到了分离的目的。由于这一过程可以把大小分子分开，犹如过滤、过筛。所以凝胶色

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农信１３０１ 黄海 谱又叫凝胶过滤，分子筛色谱。由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，凝胶色谱也称阻滞扩散色谱，排阻色谱等。

目前常用的凝胶有葡聚糖凝胶（商品名称为Sephadex）、聚丙烯酰胶凝胶（商品名称为Biogel）以及琼脂糖凝胶（商品名称为Sepharose）。此外尚有这些凝胶的各类衍生物。

葡聚糖凝胶是色谱凝胶中应用最广泛的一种，是由一定平均分子量的葡聚糖（以α-1，6糖苷键连接的右旋糖苷）与甘油基以醚桥（ O CH 2 CH CH 2 O ）

OH形成相互交联形成三维空间的网状结构，成为水不溶性物质，交联度的大小可在合成时控制交联剂（一般为环氧氯丙烷）和葡聚糖的比例及反应条件来掌握，交联度大的则“网眼”小，反之，则“网眼大”。“网眼”的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。

葡聚糖凝胶的基本结构

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农信１３０１ 黄海 葡聚糖凝胶的理化性质可概括为五性，即多孔性、亲水性、不溶性、稳定性和电中性。

目前市售的葡聚糖凝胶都是珠状的，不同型号的葡聚糖凝胶用G表示（如G-25、G-200等），G后面的数字为凝胶的吸水量（毫升水/克干胶乘以10得到的数），如G-25即表示此型号凝胶的吸水量是2.5毫升/克干胶。即标号=持水量×10，标号大说明交联度小、吸水量大，也就是说凝胶的“网眼”大。凝胶色谱可分离的分子量范围从几百到数十万不等。进行工作时一般根据欲分离物质的分子大小及工作目的来选择合适的葡聚糖凝胶装色谱柱。

三、实验器材与试剂

1．实验器材

色谱柱（1.2×20cm）（×1），吸量管1ml（×1），刻度离心管（×4），小试管（1×7.5cm）（×20），烧杯50毫升（×1）、100毫升（×2），灯泡瓶（×1），滴管，葡聚糖凝胶G-50（Sephadex G-50）。

2．试剂

兰色葡聚糖2000（分子量200万以上，兰色），铬酸钾（分子量194，黄色），洗脱剂为蒸馏水。

四、方法与步骤

1．凝胶溶胀

称取3克Sephadex G-50加入到50毫升蒸馏水内，室温溶胀6小时或沸水溶胀2小时，一般常用后一种方法。沸水浴溶胀不但节约时间，而且可以消毒，还能除去凝胶中污染的细胞和排除凝胶内的气泡，溶胀应该彻底，否则会影响色谱的均匀性，凝胶溶胀后用倾泌法除去凝胶上层水及细小颗粒，反复以蒸馏水洗涤直至无细小颗粒止（细小颗粒的存在会影响色谱的流速），然后将浸泡后的凝胶抽干，用10倍量的洗脱剂平衡约一个小时，再放在灯泡瓶内抽气，除去气泡，处理好的凝胶保存在洗脱剂内备用。

本实验采用已经处理好的Sephadex G-50。 2．装柱

将洗净的色谱柱垂直装好，自柱底端出口处向管内通入洗脱剂，以去除管内和砂芯底部的气泡，待气泡排除后，使洗脱剂留在柱内3~5cm高即行关闭下部出口。将处理好的凝胶在烧杯内用一倍的洗脱剂调成悬浮液，自柱顶部沿着这内壁缓缓加入柱中，待底部凝胶沉积至1~2cm高时，缓缓打开底部出口，调节流速0.3毫升/分。随之继续添加凝胶悬浮液直至凝胶在柱内沉积至约15cm高度为止，在装柱过程中应避免柱表面的液体流干，也就是说柱床表面应始终保持有洗脱剂，装好的柱体应该没有纹路、没有节痕、没有气泡和柱顶表面平整而均匀方可投入使用，否则要重装。

3．加样

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