有还原烷基化蛋白质消化操作流程

Digest SOP

有还原烷基化蛋白质消化操作流程

1. 将所选择的胶点用1.5mm切胶笔切下，置于eppendorf (EP) 管或96孔PCR板中,并记录点号及相应的位置；

2. 加50μL DD.H2O 洗两次，10min/次；

3. 加50 mM NH4HCO3/乙腈=1：1溶液50μL，超声脱色5min或37℃脱色20min，吸干；

4. 重复步骤3，直至蓝色褪去；

5. 加乙腈50μL脱水至胶粒完全变白，真空抽干5min； 6. 加10 mM 二硫苏糖醇DTT（10μL 1M DTT，990μL 25mM NH4HCO3配制） 20μL，56℃水浴1hr；（1.54mg/ml）

7. 冷却到室温后，吸干，快速加55 mM 碘代乙酰胺IAM （55μL 1M IAM，945μL 25mM NH4HCO3配制）20μL，置于暗室45min； （10.2mg/ml）

8. 依次用25 mM NH4HCO3、50％乙腈溶液和乙腈洗，乙腈脱水到胶粒完全变白为止，真空抽干5min；

9. 将0.1μg/μL的trypsin酶储液以25 mM NH4HCO3稀释10倍，每EP管加2μL，稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4℃或冰上放置30min，待溶液被胶块完全吸收，加25mM NH4HCO3 10-15μL置37℃，消化过夜；

10. 加入2%TFA（三氟乙酸）终止反应，使TFA终浓度为0.1％，振荡混匀，离心。

说明:

1.每加一次溶液都要漩涡振荡，胶粒要完全浸没在溶液中，进行下一步操作前要把溶液吸走。

2．如果胶粒超过1.5mm3,把胶粒分成约为1.5mm3大小再进行脱色，使用的各种溶液的量也相应增加。

3．实验过程中一定要注意使用的溶液和器具的洁净，防止角蛋白污染，并戴口罩和帽子。

4．银染蛋白质点胶内消化不要脱色，步骤3、4省略, 如果需要脱色，使用100mM Na2S2O3与30mM K3Fe（CN）6 1：1混合溶液，脱色后用水洗到胶颜色透明为止。

需要准备的试剂：

乙腈，碳酸氢铵，DTT，IAM，trypsin，TFA，水

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双向电泳考染点无还原烷基化胶内消化操作流程

1．将所选择的胶点用1.5mm切胶笔切下，置于eppendorf (EP) 管或96孔PCR板中, 并记录点号及相应的位置； 2．加30μL DD.H2O 洗两次，10min/次；

3． 加50 mM NH4HCO3/乙腈=1：1溶液30μL，超声脱色5min或37℃脱色20min，吸干；

4．重复步骤3，直至蓝色褪去；

5．加乙腈30μL脱水至胶粒完全变白，真空抽干5min；

6．将0.1μg/μL的酶储液以25 mM NH4HCO3稀释10倍，每EP管加2μL，稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4℃或冰上放置30min，待溶液被胶块完全吸收，加25mM NH4HCO3 10-15μL置37℃，消化过夜；

7．加入2%TFA终止反应，使TFA终浓度为0.1％，振荡混匀，离心。 说明:

1. 每加一次溶液都要漩涡振荡，胶粒要完全浸没在溶液中，进行下一步操作前要把溶液吸走。

2．如果胶粒超过1.5mm3,把胶粒分成约为1.5mm3大小再进行脱色，使用的各种溶液的量也相应增加。

3．实验过程中一定要注意使用的溶液和器具的洁净，防止角蛋白污染，并带口罩和帽子。

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全蛋白溶液消化操作规程

一、

试剂：

1．变性缓冲液：6M Guanidine-HCl，50mM Tris-HCl,(pH8.0)或6-8M 尿素，50mM

Tris-HCl,(pH8.0) 2．1M DTT 3．1M IAM

4．50mM NH4HCO3(pH7.8) 5．Trypsin酶 二、

操作步骤：

1．将蛋白溶解于6M Guanidine-HCl或6-8M 尿素或0.1% SDS, 50mM

Tris-HCl,(pH8.0);

2．往溶液中加入1M DTT至终浓度2-5mM;

3．95℃加热15-20min或者60℃加热45-60min，冷却至室温； 4．加入1M IAM至终浓度10-25mM，室温暗处孵育45min；

5．加入50mM NH4HCO3(pH7.8)稀释Guanidine-HCl或尿素至终浓度不超过1M； 6．按Trypsin酶与底物蛋白的量之比在1：20-1：100之间，加入酶液，37℃孵

育8-12Hr;

7．再次加入同等剂量的Trypsin酶溶液，室温孵育24Hr； 8．加入2%的甲酸（FA）到终浓度0.1%终止反应； 9．浓缩样品到合适的体积。

注意事项：

1．样品中避免存在以下常见的胰蛋白酶抑制剂

Antipain (50μg/ml), antithrombin (1unit/ml), APMSF (0.01–0.04mg/ml), aprotinin (0.06–2μg/ml), leupeptin (0.5μg/ml), PMSF (17–170μg/ml), TLCK (37–50μg/ml), trypsin inhibitors (10–100μg/ml).

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SDS-PAGE蛋白质条带消化操作流程

1. 将所选择的胶条用手术刀片切下，置于eppendorf (EP) 管中,并记录条带号及相应的位置；

2. 把条带切成2mm3大小；

3. 加200μL DD.H2O 洗两次，10min/次； 4. 加50 mM NH4HCO3/乙腈=1：1溶液200μL，超声脱色5min或37℃脱色20min，吸干；

5. 重复步骤4，直至蓝色褪去；

6. 加乙腈200μL脱水至胶粒完全变白，真空抽干5min；

7. 加10 mM DTT（10μL 1M DTT，990μL 25mM NH4HCO3配制） 50μL，56℃水浴1hr； (10mM DTT 1.54mg/ml)

8. 冷却到室温后，吸干，快速加55 mM IAM （55μL 1M IAM，945μL 25mM NH4HCO3配制）50μL，置于暗室45min； (55mM IAM 10.2mg/ml)

9. 依次用25 mM NH4HCO3、50％乙腈溶液和乙腈洗，乙腈脱水到胶粒完全变白为止，真空抽干5min；

10. 将0.1μg/μL的酶储液以25 mM NH4HCO3稀释10倍，每EP管加40μL，稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4℃或冰上放置30min，待溶液被胶块完全吸收，吸走多余的酶液，加25mM NH4HCO3 30-45μL置37℃，消化过夜； 11. 加入2%甲酸FA终止反应，使FA终浓度为0.1％，振荡混匀，离心；

12. 取出溶液转到新的EP管，加50ul 60?N含0.1ú的溶液超声20min萃取，合并溶液；

13. 溶液真空干燥；

14. 加入0.1ú的水溶液20ul溶解多肽。

说明:

1.每加一次溶液都要漩涡振荡，胶块要完全浸没在溶液中，进行下一步操作前要把溶液吸走。

2．实验过程中一定要注意使用的溶液和器具的洁净，防止角蛋白污染，并带口罩和帽子。

3. 酶液不要反复冻融。 4. 银染不用脱色，可以减少第4，第5步，如果想要脱色，可以用30mM K3Fe(CN)6与100mM的溶液1：1混合，银颜色褪去后，用25mM NH4HCO3溶液洗到胶颜色透明，接着第6步。

5. 如果用MALDI检测，第14步加入0.1%TFA的水溶液5-10ul溶解多肽。

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