蛋白质3D建模,酶与底物分子模拟对接 autodock(2)

1.文献综述

1.1微生物降解多环芳烃的研究现状

1.1.1 多环芳烃的理化性质

多环芳烃（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons PAHs）是一类含有两个或两个以上苯环或者杂环的有机化合物。是有机物在不完全燃烧产生的状态下产生的是一种重要的环境污染物，迄今发现有200多种，常见的一共是16种，如图1.1。其中有相当部分具有致癌性，如苯并[α]芘、苯并[α]蒽等。PAHs分布广泛，且由于结构的差异和环数的差异，使得他们在理化性质和环境毒性方面有很大的差别，一般为固体，易升华，熔点较高（萘为80℃），沸点更高（萘为218℃），且随着环数的增加而增加。水溶性较差，极具脂溶性。此外，PAHs在生物体内有很强的积聚性，并能通过食物链富集，是强烈的致癌剂。

图1.1 常见的多环芳烃（PAHs）结构 Fig1.1 structure formula of common PAHs

1.1.2 PAHs降解菌株的来源

目前发现的能降解PAHs的生物种类包括细菌、真菌、藻类和植物等。其中研究较为成熟的降解PAHs的主要细菌有假单胞菌属，鞘氨醇单胞菌属和红球菌属，另外还包括：Pseudomons fluoresens；Mycobacterium sp; Haemophilus sp; paenibacillus sp. 在耗氧条件下参与降解的主要酶类包括双加氧酶，脱氢酶，异构酶、醛缩酶等。其中的关键酶是第一个双加氧酶-萘/菲双加氧酶 [1]。

1.1.3主要的萘双加氧酶的种类

微生物的萘双加氧酶为Rieske型萘双加氧酶。其催化PAHs降解反应的第一步——苯环的加氧，是整个降解反应的限速步骤，因此细菌的降解能力很大程度上决定于萘双加氧酶的催化活性。萘双加氧酶利用一分子氧，在还原型辅酶NAD（P）H辅助下，催化底物双加氧形成顺式二醇。反应方程式如下：

Naphthalene + NAD(P)H + H++O2 (+)-cis-(1R,2S)-dihydroxy-1,2-dihydronaphthalene + NAD(P)+

整个酶系统包括三个组分：由phnAc和phnAd组成的末端氧化酶，由phnAa构成的铁氧化还原蛋白还原酶和phnAb构成的铁氧化还原蛋白。铁氧化还原蛋白还原酶首先将NAD(P)H 氧化成NAD(P)+，将捕获的两个电子储存在核黄素上，随之发生构像的变化，并先后与2个铁氧化还原蛋白形成电子传递复合体，当铁氧化还原蛋白还原酶将电子传递给铁氧化还原蛋白的[Fe-S]中心后，铁氧化还原蛋白发生构像变化，与铁氧化还原蛋白还原酶分离，转而与末端氧化酶发生作用，将电子传递到末端氧化酶的[Fe-S]中心，最后电子经过单核铁催化中心，在末端氧化酶的作用下，消耗一个氧分子，实现底物的双加氧作用，生成带有羟基的化合物。其中，加氧酶组分phnAc（α）和phnAd（β），是α3β

3

的四级结构，六聚体，蘑菇状。3个大亚基构成蘑菇的伞盖，3个小亚基构成

蘑菇的伞柄(图1.2)。phnAc作为α亚基包含两个区域：Rieske区域和催化区域。Rieske区域中心是由2个Fe和2个S构成，其中一个Fe和His82、His103配位，另一个和Cys80、Cys100配位。催化区域活性中心由1个Fe构成，这个Fe与三个保守残基His207、His212和Asp360配位相连。而phnAd（β）作为小亚基，它的主要作用是稳定结构[2]。

目前已报道的有晶体结构的NDO来自假单胞菌Pseudomonas sp. NCIB 9816-4和Rhodococcussp strain NCIMB12038，他们的关键氨基酸和晶体结构类似，本论文以NCIB 9816-4为例，描述该类酶的结构特点:

图1.2 萘双加氧酶的α3β3六聚体晶体结构 [1]

Fig1.2 Crystal structure of naphthalene dioxygenase α3β3 hexamer [1]

A B

Fig1.3 Mononuclear iron catalytic domain (A) and Rieske [2Fe-2S] center (B) in crystal structure of

naphthalene dioxygenase α3β3 hexamer [1]

图1.3 萘双加氧酶的α3β3六聚体晶体结构中的单核Fe催化中心和(A)Rieske [2Fe-2S]中心（B）[1]

① Rieske [2Fe-2S] 结构域:由4个β折叠（3~15β折叠片）构成。

两个β折叠成三明治，夹在β14-β15-β3和β13-β6-β5之间。两个发卡结构，卡住[2Fe-2S]中心。第一个由 β7、β8形成，第一个Fe离子配基在loop中（β7、β8） 第二个由β10、β11、β12形成，第二个Fe离子配基在β10、β11之中。配位基团：Fe1是由Cys81和Cys101配位。Fe2是由His83和His104配位(图1.3B)。

② 催化结构域

是由9股反向平行的β股折叠构成。β折叠的顺序从帽子顶开始是24-25-17-18-19-20-21-22-16。且折叠股之间有密切的联系。活性中心的Fe是由His208、His213和Asp362、H2O形成配基（图1.3A）。形状类似于一个歪曲的八面双锥体，且丢失了一个配基。Asn201是一个状态不稳定的配基，与底物结合的时候消失，构象变化。 一个α亚基和另一个α亚基之间通过氢键和Asp205进行电子传递。 ③活性中心布置

活性中心到酶表面由一道峡谷，即活性中心的入口。Gorge上方有两个环状结构，掩盖了部分入口。通道最窄的的地方包括两个组氨酸和Asn201，Phe202和Phe352，并且都是疏水氨基酸。Fe下方的活性中心口袋线性排列着Asp316、Val326、Asn363、Met366、Tyr103和一个保守的盐桥在Lys314和Glu359之间。在Gorge上方有残基Ala206、Val209、Leu217、Asn297、Leu307和Trp358。催化活性中心的Fe2+是通过Rieske 中心从铁氧化还原蛋白获得电子再生[3]。

Rhodococcussp strain NCIMB12038与Pseudomonas sp. NCIB 9816-4同源性仅为30%，但NCIMB12038也包括两个金属中心，Rieske domain和活性中心，铁原子的配位基团类似，且除表1.1所示几个关键氨基酸不同外，其它关键氨基酸皆相同。另外，二者结构最大的区别是NCIB 9816-4的N-端是meandering loop，C-端是α螺旋，而NCIMB12038的N-端是α螺旋，C-端是无α螺旋[4]。

表1.1 Rhodococcussp strain NCIMB12038与Pseudomonas sp. NCIB 9816-4萘双加氧酶的不同

关键氨基酸[4]

Table 1.1 the Amino acid difference in the catalytic domain between Rhodococcussp strain NCIMB12038

and Pseudomonas sp. NCIB 9816-4[4]

Pseudomonas sp. NCIB 9816-4

V209 F307 F368 H295

Rhodococcussp strain NCIMB12038

T217 L307 W358 N297

另外，目前已经获得晶体结构且同属于Rieske型双加氧酶的来自于鞘氨醇单胞菌属Sphingobium yanoikuyae B1的联苯双加氧酶和Pseudomonas sp. NCIB 9816-4的相似度为43.5%，但由于活性中心入口处周围侧链的差异，导致其底物入口变大；并且在形成的活性中心的21个残基中，有六个残基不同（表1.2），使其活性中心容积变大。这些结构差异导致Sphingobium yanoikuyae B1能催化五个苯环的大的多环芳烃化合物，且能利用联苯或多环芳烃萘、菲、蒽作为它们的唯一碳源。

表1.2 Sphingobium yanoikuyae B1与 NCIB 9816-4相比活性中心氨基酸差别[5]

Table 1.2 the Amino acid difference in the catalytic domain between Sphingobium yanoikuyae B1 and

NCIB 9816-4[5]

NDO-OB1 NDO-P Thr308 Ser310 Leu356 Trp358 Phe224 Leu223

Phe235离活性中心较远；Leu223的侧链体积小。Ros的活性中心入口类似一个倒置的漏斗，一个狭窄的孔通往一个宽阔的大厅[5]。 1.1.4 萘双加氧酶对PAHs降解情况

通过对NDO-P 降解PAHs 数据的了解，我们可以充分了解酶对不同环数的多环芳烃的降解能力，针对最难以降解的底物进行研究。降解数据见表1.3[6]。

表1.3 NCIB 9816-4降解PAHs 的情况

Table 1.3 the survey of PAHs degraded by NCIB 9816-4

cis-Dihydrodiol

Stereochemistry

Relative yield (%)

Naphthalene

(+)-1R,2S 100%

Anthracene

(+)-IR,2S 100%

Phenanthrene

(+)-3S,4R 90%

Acenaphthylene

cis- 1,2 70%

Fluorene

3S,4R 85%

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