NO的产生与信号途径(2)

应中形成了过氧亚硝基。在基于叶盘法的HKGreen-2实验中，当使用无毒性的.P.syringae处理拟南芥叶片时，3~6小时后检测到过氧亚硝基。同样，在用激发子INF1处理烟草细胞时，6小时后APF的量也达到了最大(Saito et al..2006)。在这两个试验中表明，过氧亚硝基的积累与HR和蛋白色氨酸硝基化程度一致。尽管已经发现硝基化在防卫/胁迫反应和氧化调节中起作用，但是其防卫信号途径还仍然不清楚。

3 NO在植物抗病性的功能 3.1 NO在过敏性细胞死亡的作用

过敏性反应是病原菌侵染时植物在局部形成坏死斑以限制病害进一步侵染和扩散的反应。R基因调节抗性的普遍特性是直接受侵染或周围细胞的死亡，这种现象被认为是拒绝给予入侵的活体寄生病原提供营养。尽管HR抵抗策略对寄主植物的很重要，HR很多分子机理仍然不清楚。为了更透彻地研究HR，植物病理学家开始寻求与动物中被称为细胞凋亡的程序性死亡(PCD)的相同机理，尤其是解释NO的作用。NO能至少通过两种途径来调节细胞死亡。第一种途径：NO可能将乌头酸酶转化成离子调节蛋白(IRP)，铁离子调节蛋白调节编码在铁离子稳定中发挥作用蛋白的mRNAs转录和稳定性。结果自由铁离子浓度增加，产生芬顿反应(Fenton reaction)，从而形成羟基HO-，HO-创造了一个宿主和病原致死的环境。第二种途径：NO与O2?反应产生过氧硝酸盐(ONOO?)，过氧硝酸盐在细胞程序死亡中起着重要作用(J?rg Durner et al.,1999)。

在动物中，NO通过与O2反应来与ROIs共同形成ONOO–, ONOO–可以调节细胞的受损，ONOO-能与许多细胞元件作用从而破坏细胞活性，而在植物中则对ONOO–具有一定的抵抗性。植物在没有被病原侵染时，处于了富含ONOO-的环境条件下，这样在光合作用的组织中就不可避免的产生了NO，这也就解释了为什么植物对ONOO-的抵抗作用的水平是如此高。动物细胞暴露在1~1000μM溶度范围的ONOO-时，细胞死亡与溶度成线性相关，而大豆悬浮细胞则能抵抗1 mM的ONOO-。另一报道0.1mM ONOO-浸入拟南芥叶片时导致明显的坏死病斑(Jeum et al.,2008)。

NO最早是在被注入无毒性细菌的大豆中发现的，随后在注入P.s.pv. Maculicola的拟南芥悬浮细胞和P.s.pv.tomato的烟草产生HR时也发现了NO。

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而白粉病菌 Blumeria graminis f.sp.hordei诱导大麦表皮细胞短暂的 NO暴发发生在HR相关的细胞崩解之前(María et al.,2004)。实验证据表明NO在植物防卫中起着中心作用，可能与氧化反应中间体(ROIs)的结合有关，而植物对潜在病原的最快速的反应之一是产生NO和ROIs。试验证据表明在细胞死亡时O2被SOD歧化成H2O2的量不断积累，因此认为细胞死亡是通过NO与H2O2而不是与O2的反应来实现的(Zago et al.,2006)。在过敏性坏死反应中，单独NO不能在大豆中诱导PCD，细胞死亡是依赖与NO和ROIs的均衡比例。如果过氧化物的水平高于NO水平，NO与过氧化物反应形成过氧硝基盐，则不能诱导PCD。然而如果NO的水平高于过氧化物水平，则NO与H2O2反应诱导PCD(Steven et al.,2003)。

NO诱导的细胞死亡是通过引发蛋白酶起关键作用的反应，半胱氨酸蛋白酶在大豆细胞的过敏性死亡中起关键的调节作用，半胱氨酸蛋白酶具有广泛的细胞靶标(Creagh et al.,2003)。RD21 是拟南芥中一个编码半胱氨酸蛋白酶的基因，在拟南芥和烟草中过表达该基因会阻滞无毒病原菌和亚硝化胁迫诱导的细胞死亡。最近Chichkova 等发现了一种与TMV诱导烟草 HR 有关的特异 caspase 蛋白质片段，哺乳动物 caspase-1 的不可逆抑制剂，能阻滞 NO诱导的过敏性细胞死亡。

3.2 NO与植物抗病性

NO除了在过敏性坏死反应起作用外，在植物抗病性中也发挥作用。在植物中，大规模基因表达分析鉴定了很多被NO调节表达的基因。通过用气态NO或是NO供体处理拟南芥植物或是细胞显示有342个基因的表达受到调控，而在拟南芥的根部受到调控的基因数量就显著少的多，在烟草中同样发现了数个受NO调控的基因(Frank et al.,2010)。这些结果显示NO应答基因大部分是于外界压力相关并且有广泛功能的基因，这些功能包括植物抗性，氧化应激反应等。用NO供体处烟草或是悬浮细胞导致抗性相关基因的表达，这些基因包括编码苯基丙氨酸(PAL)、病程相关蛋白(PR1)、水杨酸调节信号，而这些基因在植物抗病性中起着重要作用。随后的更多的研究表明NO能调节编码效应和调节蛋白的基因。然而，最近在过氧化氢酶缺陷突变体中，发现一部分特异基因由NO或H2O2调节，而目前被鉴定的基因中大多数是由这两者共同调节的，这也表明这两种不同的氧

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化还原的信号分子在基因靶标上有重叠。

早在1998年Delledonne就报道了NO与植物抗病性有关，他们发现表达avrRpm1无毒基因的细菌病原P. syringae pv. tomato (Pst) DC3000本来在烟草中不相容，而当将NOS的拟制子L-NNA和PBITU浸入植物时，DC3000的生长增加了，这表明NO在R基因调节的对病原的抗性中发挥着作用。NO也被认为在被随后脂多糖(LPS)识别触发的基础抗性、病原相关分子模式(PAMP)中起作用(Luis et al,.2006)。AtNOA功能缺失时，在对LPS应答时NO的积累也消失了，抗性相关的转录积累也减少了，而最重要的是对病原物PstDC3000的抵抗也降低了。总之，这些数据显示NO在基础抗病性中起着重要的信号作用。

NO和SNOs在抗病性的作用也发挥着重要作用。在动物中，S-硝基化是作为基于氧化反应的翻译后修饰，并在细胞应答中支持着NO信号功能(Lee et al.,2008)。S-硝基化蛋白的三肽与SNOs反应形成亚硝基谷胱甘肽(GSNO)，并导致蛋白硫醇化(SH)(Palmieri et al.,2010)。最近在植物发现了一种能有效转换GSNO的酶。拟南芥缺失GSNO还原酶功能的突变体，结果SNOs的细胞水平增加，而在增加GSNO还原酶功能的突变体中，AtGSNOR1表达增加，并且GSNO的转换也提高了。更重要的是缺失AtGSNOR1活性时，NHR对小麦白粉病Blumeria graminis f.sp tritici妥协了(Feechan et al., 2005)。此外(Romero-Puertas et al., 2008)，在缺失AtGSNOR1突变体中，发现在应答入侵病原或外源SA处理时依赖SA基因表达被减少和推迟了，同时SA的积累也消失了。相反增加AtGSNOR1活性则提高了依赖SA的基因表达。因此GSNO还原酶调节SA的合成和信号传导。NO和SNOs在抗病性的作用如图3所示：

图3 NO和SNOs在抗病性的作用

Fig 3 Proposed roles of NO and SNOs in plant disease resistance

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很多先天性抗病性都与抗病基因表达有关，在植物中NO信号传递给抗性基因表达通常是包括激活鸟苷酸环化酶和增加cGMP水平。NO诱导的PR1和PAL1基因与SA的合成有关，并且NO能导致SA积累，但是拟制了由茉莉酸调节的信号途径。SA在HR调节的抗性中起着关键作用，部分是通过PR蛋白的诱导和增强大量抗性基因表达和氧化爆发。NO能通过改变植物中SA水平来调节植物抗病性。研究发现转基因烟草NahG不能合成SA，NO处理不能诱导PR 1的表达，表明NO诱导的PR 1表达需由SA介导。而且NO供体处理试验中，将TMV接种于烟草，NO处理能减轻野生型烟草过敏反应形成的坏死斑，而对NahG烟草却没有影响，相反NOS抑制剂或NO清除剂处理能减弱SA诱导的SAR。此外NO能激活烟草中 SA诱导的蛋白激酶和拟南芥中一个受Ca2+和Ca2+结合蛋白调节的MAPK级联反应。这些试验结果说明 NO在植物 SAR 的信号转导途径中起重要作用，但其活性完全依赖于SA(Zottini et al.,2007)。 4 展望

NO现在被确定为许多物种中一个关键的信号分子。在植物中，NO把许多新陈代谢协调的结合起来。在植物的抗病反应中，NO信号调节气孔的关闭、抑制开花、阻止一些酶的活性、激活丝裂原激活蛋白(MAP)激酶信号通路、调节细胞循环基因的表达、参与花粉管的重新取向、降低种子的休眠和刺激种子萌发。NO还调节许多合成和对应答茉莉酸的基因、病原应答、乙烯合成和信号传导、苯基丙酸类合成途径、蛋白抗氧化机制、光合作用、细胞运输、细胞死亡和一些其他基本代谢途径。据推测，NO还在柱头对花粉识别的生殖机制等过程中起作用。此外诱导cGMP水平的增加，并且也增加细胞内Ca2+自由离子。在植物中还有很多与NO有关的机制，包括抗逆和抗病机制都有很多地方未阐释清，今后对NO的研究包括植物NOS基因的克隆、亚硝基化作用的分子调控机制及与翻译后修饰的生理功能的相关性等。

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