生物质谱在蛋白质组学研究中应用

在pH=4-5的KH2PO4缓冲体系中，37℃,标记反应持续：19h-24h （2）、标记稳定性（胰酶灭活）条件的优化

微波初灭活；TCEP还原胰蛋白酶的二硫键并用碘乙酰胺封闭及和盐酸胍胍基化灭活。

标记肽段于-20℃放置一个月后，仍非常稳定。没有回交现象出现。说明优化之后的18O标

记技术可以有效抑制18O-16O回标现象。

一个月后1:1标记磷酸化肽段质谱图 （3）标记方法的动态范围及灵敏度

四个磷酸化肽段25倍动态范围时，标记的线性相关系数R2均可达0.99以上，标记误差在23%以内（样本量是1:1时标记误差最小），呈良好的线性关系。

将四

个肽段的标记比值取平均值后，标记的线性相关系数R2更高，结果更接近真实值，所以采用多肽段对蛋白质进行定量的策略可保证更高可信度和准确度. 该方法在LTQ-FT质谱仪中的灵敏度为：50 fmol

（4）18O标记磷酸化肽段在IPG-IEF与SCX分离富集路线中稳定性的考察

18O标记肽段在IPG路线中的稳定性远远高于 在SCX路线中的稳定性.

（5）18O标记磷酸化肽段在TiO2分离富集路线中稳定性的考察

18O:16O=1:1的样本脱盐及TiO2富集标记值基本不变

通过以上的实验条件的优化，确定了18O-IPG-IEF-TiO2-LTQ-FT用于磷酸化蛋白质组学相对定量分析的技术路线，该技术路线已经用于HepG2/HepG2-HBx细胞模型的磷酸化蛋白质组定性及定量研究。

七、蛋白质组学研究面临的主要技术挑战

1、高丰度蛋白质的去除低丰度蛋白质的有 效富集与识别；

2、高效分离技术和高灵敏度检测方法的建立； 3、与功能密切相关的翻译后修饰和蛋白质变 体(variant)信息的获得；

4、高通量鉴定中的判据以及假阳性和假阴性 问题；

5、绝对和相对定量蛋白质学技术平台的建立。

生物质谱在蛋白质组学研究中应用

张养军 钱小红

军事医学科学院放射与辐射医学研究所

北京蛋白质组研究中心

主要内容：

一、蛋白质组学发展简介 二、蛋白质组研究意义 三、蛋白质组学研究的内容 四、蛋白质组研究中的复杂性 五、蛋白质组学研究的主要研究策略 六、生物质谱在蛋白质组学研究中的应用 七、蛋白质组学研究中的主要技术挑战

一、蛋白质组学发展简介

蛋白质组（proteome）：

一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套蛋白质。

蛋白质组学（proteomics)：

研究细胞、组织或生物体中蛋白质组成、定位、变化及其相互作用规律的科学。

简要历史回顾：

1994年，澳大利亚的科学家首次提出蛋白质组概念； 1995年，蛋白质组一词首次见诸报端；

2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织(Human Proteome Organization, HUPO)，随后欧洲、亚太 地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过 合作的方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白质 组计划(Human Proteome Project)；另外，除了相关 期刊外，创刊了蛋白质组学专门杂志，如 《Proteomics》、《Molecular & cellular

proteomics》和《Journal of proteome research》； 2002年～现在，已经举行了七届HUPO国际会议和四届中国蛋 白质组学术大会。

二、蛋白质组研究的意义

1、一些物种如小鼠、大鼠等基因组测序工作的完 成，特别是人类基因组计划草图完成（2001 年），为蛋白质组计划的实施奠定了基础。蛋白 质组的研究不仅是基因组研究的深入和延续，更

重要的是要回答在基因组和转录组水平上无法回 答的生物学问题，比如它们之间的连锁关系以及 功能网络等。

2、作为生命功能的执行体——蛋白质组的研究是 为了从更高层次上深入解读生命的本质和生命 活动的规律。

3、为人类疾病的病理研究、早期诊断、治疗以及 药物开发提供依据。

三、蛋白质组学研究的内容 1、蛋白质组表达谱

（proteome expression profiling）

针对已有基因组或转录组数据库的生物体、组织或细胞，建立相应蛋白质组或亚蛋白质组数据库。如：Human plasma proteome project；Human liver proteome project。 2、蛋白质组修饰谱

(proteome modification profiling)

建立生命功能执行和调控网络相关的蛋白质 翻译后修饰数据库。 3、基本生物学问题

研究与生命活动过程中密切相关的问题。 比如：Post-translational modification；

Protein-protein interaction；

Genome-Transcriptome-Proteome。 4、临床应用问题

以重要的生命过程或人类一些重大疾病为对 象，进行重要的生理和病理体系或过程的研究， 即进行比较蛋白质组学研究。 比如：Disease marker-diagnosis

Mechanism of the disease Drug target-therapy

5、蛋白质组学中的新技术和新方法

建立蛋白质组学支撑技术平台以及生物信息 学研究工具。

四、蛋白质组研究中的复杂性

一种细胞、组织或生物体有多少蛋白质? 人类基因组含有3～4万个基因，仅是果蝇 或线虫的两倍左右。

人体：1个受精卵 1012细胞，103细胞类型。

其“蛋白质组”随“时” 、“空” 处于变化之中，而“基因组”则处于永恒于之中。 生命体的统一性源于基因组 生命体的复杂性基于蛋白质组

五、主要研究策略

1、研究基础

（1）生物学的发展，特别是基因组测序的 完成为我们提供了蛋白质组数据库； （2）生物质谱和分离科学的进步为我们提 供了分离和鉴定的必须手段； （3）计算机技术的提高，特别是生物信息

学的发展为我们处理海量数据提供了

有力的支持。

2、蛋白质组学研究方法分类 （1）蛋白质定性分析 依据分析对象是整体蛋白质混合物或酶切后的多肽混合物，蛋白质组的定性分析方法分为自下向上法（bottom up,针对多肽混合物）和自上向下法(top down，针对整体蛋白质混合物)。

依据蛋白质数据库中是否存在所鉴定的蛋白质，蛋白质组的定性分析方法进一步分为： 对蛋白质数据库中含有待鉴定的蛋白质，包括:肽质量指纹谱法（PMF，适合于简单蛋白质混合物);肽序列标签法（PST，适合于复杂蛋白质混合物）

对蛋白质数据库中不存在待鉴定的蛋白质，采用从头测序法（de novo） （2）蛋白质组相对定量分析方法

① 直接进行比较，包括SDS-PAGE、2DE、HPLC； ② 标记方法，包括同位素标记亲和标签 （ICAT）、元素标记亲和标签（ECAT）、 同位素氨基酸细胞培养标记(SILAC)和 DYGE技术；

③ 直接同位素标记法，如酶促18O标记。 3 蛋白质组研究方法进展

(1)复杂蛋白质组体系

目前对于组织、细胞和血浆等复杂蛋白质组的分析，均采用多维分离技术与质谱联用的方法。

结 论

建立了一种以稀土元素为质量标签的自主创新的定量蛋白质组新方法，该方法具有以下的优点：

? 化学试剂价廉易得

? 化学标记反应条件温和，为普遍标记，无肽段歧视

? 肽段的二级图谱为连续的y系列离子，可提高蛋白鉴定的可信度

? 有８种稀土元素是单同位元素，有28种自由组合，可大大扩展质量标签的

选择范围

基于酸酐双功能试剂修饰辅助、结合

稳定同位素18O标记的蛋白质组定量新方法

方法特点

? 化学18O标记方法，无回交现象；化学与酶切结合的18O标 记方法，无同位素峰重叠

? 标记肽段在MS/MS谱图中是连续的y系列离子，简化图 谱，提高鉴定可靠性

? 标记试剂价廉易得、反应简单快速、反应体系兼容，为 普遍标记的方法

? 同一样本两种18O标记定量方法，节省样本准备的时间、 减少实验误差。

? 两种定量结果可以互相验证，显著提高蛋白质组定量的 准确性和可靠性。

乙酸酐稳定同位素标记-液质联用蛋白质组相对定量新方法

开发了自动化定量分析软件：MSAQ MALDI MS 实验流程

ESI MS 实验流程

方法特点：标记试剂价格低廉、反应条件温和。

应用1：国际脑脊液项目合作研究项目，即亨廷顿病人脑脊液中蛋白质的 变化；

应用2：对正常对照（S0）、无症状携带（S1）、肝炎轻度（S2）、中度 （S3）和重度（S4）肝炎五期血浆样本进行了定量分析，发现具有 两倍以上差异的蛋白质185种。

应用3：功能蛋白质组承担的肝纤维化血浆标志物研究课题。 建立18O稳定同位素标记-质谱用于磷酸化肽段或 磷酸化蛋白质的相对定量的方法 基本原理

关键问题（1）第一步标记反应的完全性，即期望只得到+4Da的标记产物；

（2）标记完后胰蛋白酶的彻底灭活，避免回交发生； （3）质谱峰面积和强度定量。

影响因素考察

（1）反应时间的考察

生物素法富集膜糖蛋白流程图

三个富集技术路线

①：肽段水平富集；②：蛋白水平富集；③：两次富集(蛋白/肽段) (3000cutoff：3000Da超滤) 质谱图显示糖肽富集效果 富集前

富集后

三条富集技术路线结果

HepG2膜糖蛋白分析

蛋白水平富集酶切后，其肽段体系复杂程度和动态范围都大大增加，低丰度糖肽的检出几率会大大减小，因此，采用肽段水平富集方法。

论

（1）从蛋白水平富集，对HepG2细胞膜糖蛋白进行研究，共 鉴定 到171个跨膜蛋白， SP库确认其中44个蛋白是糖 蛋白。

（2）从肽段水平富集，对HepG2细胞膜糖蛋白进行研究，鉴 定到70个非冗余糖肽，73个糖基化位点，其中3个肽段 各 有2个糖基化位点。糖肽对应于48个非冗余糖蛋白。

（3）合并蛋白和肽段富集 鉴定结果，共 83个HepG2膜糖蛋 白，73个糖基化位点，构建了HepG2肝癌细胞膜糖蛋白 数据。

（4）这些膜糖蛋白主要是一些免疫相关蛋白、转运蛋白、癌 症转移相关的细胞粘附因子以及膜受体等，参与了炎症 反应、细胞粘附、信号转导等多种重要生理过程。 3、蛋白质定量新技术新方法 蛋白质定量新技术新方法

蛋白质（组）定量的意义

(1)作为生命执行体的蛋白质，通过其定位、修饰和相互作用 发挥功能作用时都与其量的多少相关；

(2)蛋白质标志物的发现与相对定量方法相关；

(3)蛋白质标志物的临床应用也涉及到绝对定量方法；

结

(4)蛋白质组学（表达谱、修饰谱和相互作用）已经向动态蛋 白质组学发展，必然要求定量方法的支持。

拟解决的关键科学问题

(1)规模化蛋白质组绝对定量方法的建立；方法的灵 敏度、重现性和动态范围优化。

(2)不同状态中低丰度蛋白质组的相对定量；相对定 量方法动态范围、覆盖率和准确度。

(3)非标记定量模式与科学合理的新算法。

蛋白质定量内容：

蛋白质的定量包括绝对定量和相对定量，其蛋白质定量的研究对象包括：

(1)纯化后蛋白质的绝对定量； (2)总蛋白质的绝对定量；

(3)复杂生物体系中一种或数种蛋白质的绝对和相对定量； (4)复杂生物体系中大多数及全部蛋白质的绝对和相对定量。 蛋白质定量的常用方法

(1)基于光吸收或发射性质的光谱定量方法，如紫外及 可见光吸收和荧光定量方法；

(2)基于色谱或毛细管电泳与紫外光吸收定量方法； (3)基于同位素稀释的质谱定量方法；

(4)基于凝胶电泳和光密度度的定量方法； (5)基于抗体和荧光标记的定量方法； (6)蛋白质相对定量方法。

目前国内外蛋白质定量研究现状

绝对定量方法

（1）光谱定量

280 nm 光吸收蛋白质定量法；

LOWRY蛋白质定量法或改进 LOWRY蛋白质定量法； BCA蛋白质定量法法； BRADFORD蛋白质定量法； Fluoraldehyde蛋白质定量法；

ELISA蛋白质定量法等。

(2）稳定同位素稀释法（内标法）用于质谱法进行蛋白质的 绝对定量；

（3）多反应检测蛋白质或肽定量法；

（4）规模化蛋白质的半绝对定量方法（基于统计方法）。 采用蛋白鉴定的分值与相应蛋白质的丰度的关系 进行半定量的方法；

蛋白质丰度指数（PAIs，protein abundance

indices）与相应蛋白质丰度的关系进行半定量的方法； 指数蛋白质丰度指数（emPAIs，exponentially modified protein abundance indices）与相应蛋白质 丰度的关系进行半定量的方法。

相对定量方法

（1）在蛋白质水平上，基于两维分离或与荧光标记结合的比 较方法，如2DE、PF-2D和DIGE；

（2）基于质谱技术的不同状态的同一种肽段提取的离子流色 谱图比较的方法（非标记定量）； （3）稳定同位素标记方法，包括化学标记和代谢标记，如18O 水标记、同位素酸酐试剂标记、同位素醛试剂标记、 cICAT、iTRAQ和SILAC等; （4）双功能试剂结合金属标记的方法;

(5) 同系物标记-SDS-PAGE或2DE结合质谱的蛋白质相对定量 方法。

iTRQA试剂结合生物质谱用于蛋白

质组的相对定量方法

基本原理

（1）试剂的反应基团（PRG）特异地与肽段的N-端氨基和Lys的ε-氨基结合；

（2）平衡基团与不同质量的报告基团在一级质谱图上显示为一个峰，为肽段质量数加上144 Da；

(3) 在二级质谱图上，报告基团特异性地断裂，其比值即为两样本中蛋白的相对定量。

考察因素

（1）标记完全程度；

（2）动态范围(30倍，相对误差<30%)； (3) 灵敏度;

（4）色谱行为，同位素效应不显著； （5）质谱行为，主要为y离子序列。

通过实验的考察和优化，建立了iTRAQ标记试剂结合MALDI TOF-TOF MS的蛋白组相对定量方法。

应用：脂肪肝大鼠肝组织全蛋白

注意事项：

（1）不能引入带有伯氨基的试剂（还原剂：TCEP；半胱氨酸残基封闭剂： MMTS（硫甲磺酸S-甲酯 ））； （2）标记过程中水相比例：小于30％；

（3）体系不能肽复杂，即对于复杂生物样本需要预分离步骤。 SILAC标记结合生物质谱定量蛋白质组方法的建立和应用

细胞培养的稳定同位素标记技术(SILAC)的基本原理：分别用含有天然同位素和稳定同位素标记的必须氨基酸取代细胞培养基中的相应氨基酸，通过5-6代的细胞传代，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞合成的蛋白质中，从而实现基于质谱的蛋白质组定量分析。

方法特点：简单、直接、高效、准确。

应用：寻找阳性率高、特异性强的肝癌标志物的研究课题。

通过对甲胎蛋白阳性肝癌细胞系和甲胎蛋白阴性肝癌细胞系差异比较研究，发现了一批甲胎蛋白阴性的差异蛋白，其中蛋白分子TGM2在甲胎蛋白阳性和阴性肝癌细胞中有显著差异，有可能成为肝癌诊断的标志物。 DTPA螯合稀土金属标签蛋白质组定量 原理和方法流程图

实验方法考察

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