人胰岛素的制备

人胰岛素的制备

一、 获得目的基因

从供体细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成胰岛素mRNA互补DNA，再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶I的作用在，最终合成编码它的双链DNA序列。即得到了目的基因。 反转录-聚合酶链反应法

(一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA 1, 细胞总RNA的提取 :

取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZOL试将细胞破裂，后用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳。 2 ，从总RNA中分离mRNA：

取上述提取的总RNA若干，加入Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打匀。 70℃水浴（裂解RNA的二级结构）， 20-30℃条件下，静置（让Oligotex与mRNA结合）。 将Oligotex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Buffer将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。 （二）mRNA转录合成cDNA第一链 cone 第一链的合成

加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-free water，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、 RNA酶抑制剂、反转录酶、 dNTP（加入放射性同位素利于检验）， 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。取出置于冰上。

电泳分析，同位素活性测定。

（三）PCR法扩增，特异合成目的cDNA链

通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行扩增，特异的合成胰岛素的cDNA链 。

PCR法的操作步骤： 预变性 引物退火 引物延伸 循环25-35次 最后延伸

? 前端引物：

? 5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’

? 后端引物：

? 5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’

二、 组建重组质粒

采用pQE--30质粒作为载体，用双酶切法进行基因重组。 １.双酶切法

用两种酶限制性内切核酸酸消化载体DNA和外源DNA片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组DNA分子，从而实现DNA的定向连接。 ２.重组过程

pQE--30用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外源DNA片段同样也用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体外源DNA片段混合退火，因为Hind Ⅲ和BamHⅠ的黏性末端不匹配，避免了载体和外源DNA片段的自身连接，外源DNA片段只能定向地连接到载体的Hind Ⅲ和BamHⅠ位点之间。当然也不可避免发生载体的Hind Ⅲ和BamHⅠ的黏性末端之间的两个碱基互补形成开环，转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子占少数，是低效转化。

三、构建基因工程菌

(一) 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 A链和B链同时表达法

将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌-半乳糖苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋白经CNBr处理后，分离纯化A-B链多肽，然后再根据两条链连接处的氨基酸残基性质，采用相应的裂解方法获得A链和B链肽段，最终通过体外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。重组DNA的转化

1, CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞：

取100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体，用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心，收集菌体，用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 ，冰浴放置12 - 24小时，备用。 2，大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：

取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组，DNA连接液，混匀。冰浴放置半小时 。在42 ℃保温 2 分钟（热脉冲），快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 – 2 分钟 。加入1 ml 新鲜培养基，于37 ℃培养 1 小时（扩增） 。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。 经典的CaCl2转化方法：

a将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

b 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。

c弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

d 感受态细胞分装成200μl的小份, 贮存于-70℃。

e从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。

f 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。

g42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。

h向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。

i将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 (二)重组子的筛选和鉴定（载体遗传标记检测） 1.初筛选

随机挑取转化单菌落，在LB／AK培养基(含100p g／ml氨苄青霉素和50ug/ml卡那霉素)中进行培养，用O.5mmol／LIPTG诱导表达。 表达情况用16．5％SDS．PAGE进行分析。 2.重组菌的后续鉴定 直接电泳检测法

将初筛选获得的重组菌扩大培养后，提取其质粒DNA，通过PCR对其进行扩增，利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大，用电泳法检测质粒是否为重组质粒。 目的蛋白表达检验

所得菌体经溶菌酶／超声破碎细胞后得到的包涵体进行SDS—PAGE分析，所需基因工程菌表达的外源蛋(His)6·Arg-Arg-人胰岛素原以包涵体形式存在，其分子大小约为13kb，经电泳与胰岛素原marker对比，如条带显示有所需目的蛋白，则所得菌既可做工程菌使用，经扩大培养后，斜面保存以便后续使用。 3.工程菌的保藏

15%甘油保存菌种，菌液=20:80,,充分混匀后,-70度保藏。

四、 培养工程菌

优化发酵条件

采用比浊法测定不同时间培养基中菌量， 绘制基因工程菌的生长曲线，在摇瓶培

养的水平下，采用优化的发酵培养基发酵基因工菌，培养4小时候即进入对数生长期，而且对数生长期可延长至17小时。 1，正交优化实验：

采用正交法，选取摇瓶培养条件中七个主要因素进行两水平正交优化，该七个因素为：种子活化方式，摇床转速(通风量)，IPTG诱导温度，接种量，IPTG添加量，诱导时间，补料方式。分别用A、B、C、D、E、F、G表示．以每升培养基收获湿菌体的量及发酵液的A600为目标量，考察条件优化的效果，进行八次实验，对实验结果进行分析，优化出最佳实验条件。 2，其他条件优化：

在优化发酵条件的基础上，进一步就各种金属元素对苗体生长发重 组蛋白诱导的影响作了分析。

3，放大培养（比较不同发酵工艺产量）：

在优化摇瓶水平发酵试验的基础上，放大至1 L培养基中比较两种 发酵工艺。在不同转速，通气量，pH条件下，比较选择产量最高的发酵工艺。

五、 产物分离纯化

由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。

基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。

发酵液进行细胞分离，分别得到胞内产物和胞外产物。

胞外产物直接进行透析浓缩然后进行再复性及酶转化，再对产物进行高度纯化，最后制剂即可。

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