载体构建程序

载体构建一般程序

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提取拟南芥叶片DNA 设计引物 获得目的基因片段 特定的限制性内切酶酶切 基因片段连接入质粒 连接产物转化进感受态细胞中 摇菌，PCR检测插入基因 测序

各步的具体内容：

1、 提取拟南芥叶片DNA：Mini-scale genomic DNA extraction from Arabidopsis

leaves，野生型拟南芥的叶片的DNA。

2、 设计引物：对于用于普通的PCR的基因的引物设计，要符合以下几个条件：

（1）引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 （2）产物不能形成二级结构。

（3）引物长度一般在15~30碱基之间。 （4）G+C含量在40%~60%之间。 （5）碱基要随机分布。

（6）引物自身不能有连续4个碱基的互补。 （7）引物之间不能有连续4个碱基的互补。 （8）引物5′端可以修饰。 （9）引物3′端不可修饰。

（10）引物3′端要避开密码子的第3位。

如果要用于酶切的基因，除了满足以上的条件外，首先需选择合适的限制性内切酶，需要满足：（1）所要连接的质粒上有该酶切单克隆位点；（2）目的基因中没有该酶切位点；（3）在基因本身的引物5’端加上所选酶切位点识别碱基序列；（4）根据情况在引物5’端或3’端加上保护碱基，一般只在5’端加保护碱基就行了。

3、 获得目的基因：使用高保真酶Prime STAR HS DNA Polymerase,以提取的WT

DNA为模板做PCR，获得所需目的基因片段。 反应体系：

5*prime STAR Buffer (Mg2+ plus) 10ul dNTP Mixture (各2.5mM) 4ul 引物1（10uM） 1ul

引物2（10uM） 1ul 模板DNA（WT） 2ul Prime STAR HS DNA Polymerase（2.5u/ul） 0.5ul

灭菌水 up to 50ul (31.5ul) 反应程序：94℃ 4min; 98℃ 20s; 55℃ 30s; 35 cycles 72℃ 70s; 72℃ 10min; 12℃ -----

PCR反应结束后取所有反应液进行琼脂糖凝胶电泳，之后进行胶回收。回收产物用不少于30ul的灭菌水溶解后，取5ul电泳检测回收片段。 胶回收：使用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，其步骤为： 1、 从琼脂糖凝胶中割下含目标片段的胶块，称重；

2、 加入胶块重量的4倍的Buffer B2，50℃水浴5-10min溶胶；

3、 将溶胶液移入吸附柱中，可室温静置2-5min，8000g离心30秒，倒掉收集管中的液体；

4、 加入500ul Wash Solution，9000g离心30秒，倒掉收集管中的液体； 5、 重复步骤4一次；

6、 空吸附柱于9000g离心1分钟，开盖晾5min；

7、 将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入60℃预热的灭菌水不少于30ul，室温静置2min，9000g离心1min，保存管中DNA溶液。

4、特定的限制性内切酶酶切：要获得重组载体，首先要对获得的目的基因和所要转入的质粒用相同的限制性内切酶酶切，产生相同的粘性末端，便于连接。选择合适的限制性内切酶，在合适的条件下反应，一般反应4小时左右。 对于双酶切体系，酶切缓冲液的选择可以参照宝生物工程公司的限制酶中双酶切反应时通用缓冲液手册来选择合适的缓冲液及其反应浓度。 不同的限制酶有不同的最适反应温度，有30℃和37℃两种，如果所选的两种限制酶的最适反应温度不一样，可以先在30℃中反应2.5h，后转入37℃中反应1.5h即可。

酶切反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下含有目的基因条带的胶块做胶回收，步骤同上。 5、 基因片段连接入质粒：目的基因和载体经过酶切处理，既有相同的粘性末端，在连接酶的作用下，可以连接在一起形成重组质粒。通常使用的连接酶是TaKaRa公司的T4 DNA 连接酶。其反应体系为： 10*T4 DNA Ligase Buffer 2.5ul

DNA 片段* 约0.3pmol 载体DNA** 约0.03pmol T4 DNA Ligase 1ul

灭菌水 up to 25ul

*DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3-10倍。 **平滑末端的载体与DNA片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。

16℃过夜反应。

若Buffer出现少量沉淀属正常现象，可在37℃保温溶解后使用。 6、 连接产物转化进感受态细胞中：

感受态细胞的制备：以大肠杆菌DH5a细胞为例 1、．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜（约12h）。

2、取0.5ml 过夜培养液，接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2h。 （注：以下操作均应在冰浴中进行。）

3、将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10min，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30min。

4、4℃离心,4000g×10min，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮。

5、以50ul/管分装入1.5ml离心管中，-80℃保存备用。 转化：连接产物转化进大肠杆菌DH5a感受态细胞中。

1、 新鲜制备的或-80℃下保存的50uL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。

2、 加入10ul连接产物到50ul感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。 3、 42℃热激90s（不超过90s），期间勿摇动。

4、 冰浴2-5min，而后加入450ul LB液体培养基（不含抗生素）。 5、 37℃，220rpm，培养40min。

6、 6000g离心2min，吸去部分上清，留下大约70-100ul，涂布到LB固体培养基（含相应抗生素）平板上，均匀涂布。 7、 倒扣平板，37℃培养16-18h。

7、 摇菌，PCR检测插入基因：待平板长出菌落后，用小枪头挑取白色的单菌落于装有3ml LB液体培养基（含相应抗生素）的试管中，37℃，220rpm，培养24h。

PCR检测：取200ul培养液做PCR，可以用普通的rTaq酶，引物为扩增目的基因的引物。

质粒DNA的提取：PCR检测出目的基因后，可将该对应管中的菌液的质粒提取出来，进行检测，就可得到重组质粒。质粒DNA的提取根据碱裂解法原理使用试剂盒按照步骤进行操作提取。其步骤为：

1、 取1-4ml在LB培养基中培养过夜的菌液（按照菌液浓度不同可适当改变加入的菌液量），12000g离心1min，弃尽上清。

2、 加250ul Buffer S1（确认Buffer S1中已加入RNase A），悬浮细菌沉淀，剧烈震荡，不应留有小的菌块。 3、 加250ul Buffer S2，立即温和并充分地上下颠倒翻转 4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min。 4、 加350ul Buffer S3，立即温和并充分地上下翻转混合6-8次，12000g离心10min。步骤3和4在冰上操作效果更佳。 5、 吸取上清并转移到制备管（2ml）中，室温放置2min，12000g离心1min，弃滤液。

6、 将制备管置回离心管，加500ul Buffer W1，12000g离心1min，弃滤液。 7、 将制备管置回离心管，加700ul Buffer W2，12000g离心1min，弃滤液；

以同样的方法再用700ul Buffer W2洗涤一次，弃滤液。（加入前确保Buffer W2已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇） 8、 将制备管置回2ml离心管中，12000g离心1min。开盖室温放置5-10min，使残留的乙醇彻底挥发。

9、 将制备管移入新的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加60-80ul去离子水，室温静置2min，12000g离心1min。（将去离子水加热至65℃将提高洗脱效率）

8、测序：将检测出目的基因片段的菌液和质粒送去测序，可以鉴定目的基因是否插入成功。

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