Western Blot实验步骤(2)

在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会

发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）

（5） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电

转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。（或最好把转膜槽放置在冰浴中进

行转膜）一般用60V转移2 h或40V转移3 h。（ 通常如果使用Bio-Rad的标

准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。

也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目

的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的

转膜时间越短。）

（6） 转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染

上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。（ 转膜的效果可以观察所使用的预

染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。也可以用丽春红染色

液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的

SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。）

（五）封闭(Blocking)

将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。在整个Western过程推荐使用侧摆摇床或类似仪器，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。

（六）一抗孵育(Primary antibody incubation)

将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。（如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。）

（七）二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。

（八）化学发光，显影，定影

（1） 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混

Western Blot实验步骤

合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-

光片夹中。

（2） 在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，

用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－

光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号

的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，

以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中

显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），

温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸

入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留

的定影液后，室温下晾干。

应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。

（九）凝胶图象分析

将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

（十）膜的重复利用(Membrane recovery)

如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。

（十一）western blot的实验步骤及注意事项的资料

1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。

1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用玻棒或5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。

2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。

3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。

4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。

5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。

6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。

2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。

3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。

4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。

5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。

6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。

7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。

8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）

9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。

10. 将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。

11．按步骤9洗涤。

12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS），于室温下摇动。

注意事项：

western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的

Western Blot实验步骤

抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。

附

试剂配制：

（一）母液

1.0mol/L Tris·HCl

Tris (MW121.14) 30.29g

蒸馏水 200ml

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