Western Blot实验步骤

Western Blot实验步骤

Western Blot

操作步骤：

（一） 蛋白样品制备

选TRIZOL 法

（二） 蛋白含量的测定

（1） 制作标准曲线

1、 从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。

2、 取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0 g，2.5 g，5.0 g ，10.0 g ，

20.0 g ，40.0 g。

4、 混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff）

上比色分析。

5、

（2） 检测样品蛋白含量

1、 取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置

30min后即可用于测蛋白。

2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 l，混匀放置2分钟可做为空白

样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。

3、 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。

4、 取一管考马斯亮蓝加95 l 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5 l待测蛋白样品，混

匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample检测样品。

注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 l样品含的蛋白量。

（三） SDS－PAGE电泳

（1） 清洗玻璃板：

一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

（2） 灌胶与上样

1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要

使两玻璃对齐，以免漏胶。）

2、 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，

可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面

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快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才

不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）

3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固

就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4、 按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空

间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以

免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收

缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经

常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻

轻将其拔出。

5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板

面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向

外。）

6、 测完蛋白含量后，计算含50 g蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样

品至0.5ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总

体积一般不超过15 l，加样孔的最大限度可加20 l样品。）上样前要将样

品于沸水中煮5min使蛋白变性。（ 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分

变性蛋白。 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内

即可）（为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，

最好使用预染蛋白质分子量标准）

7、 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）

用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插

至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也

可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤

3次，以免交叉污染。

（3） 电泳

（电泳时间一般4～5 h，电压为40V较好，也可用60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。）

电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

（四） 转膜

（1） 转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切

滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜

置于水上浸2 h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，

要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。

若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。）（硝酸纤维

素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开，推

荐在Western实验中选用PVDF膜）

（2） 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和

浸过的膜。

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（3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以

擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫

三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去

其中的气泡。

（4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。

撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）

除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。

小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。

将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3

张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作

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