amy土壤整理（采样、测定，微生物）(6)

式中：c—标准曲线上查得的酚浓度，mg/ml； 10—显色液体积，ml； ts—分取倍数；

1000—毫克和微克换算系数； m—土壤质量，g。

4．脱氢酶活性的测定

试剂

（1）pH 7.6 Tris-HCL缓冲液的配制：

A：0.2 M三-（羟甲基）-氨基甲烷溶液（1000 ml含24.23克） B：0.2 M HCl

100 ml A+76.8 ml B，加水稀释至400 ml，准确调节pH为7.6 （2）1% TTC-Tris缓冲液：1 g TTC+100 ml Tris-HCL缓冲液 （3）1%葡萄糖：1 g葡萄糖+100 ml蒸馏水

（4）将2和3混合均匀，即成（0.5 %TTC+0.5%葡萄糖）-Tris缓冲溶液（pH 7.6） （5）TTC标准液：准确称取0.4%TTC溶液0.8ml放入10ml具塞试管中，加少许连二亚硫酸钠粉末，摇匀后即产生红色的TTCH(TPF)，再用甲醇定容至刻度，摇匀。此时溶液浓度为TTCH 320 ug/ml。 实验方法

（1）操作步骤：称取4克鲜土于50 ml三角瓶中，加入4 ml（0.5 % TTC+0.5%葡萄糖）-Tris缓冲溶液（pH 7.6），置37 ℃暗室培养24小时。取出后用少量甲醇提取后过滤，再用50 ml容量瓶定容。滤液马上在485 nm波长下比色。 （2）TTC标准曲线绘制：TTC标准液中吸取0.25 ml、0.5 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml置于10 ml具塞试管中，用甲醇定容至刻度，得到8、16、32、48、64 ug/ml的TTCH溶液。以甲醇作为空白，480 nm波长下比色，绘制标曲。 计算公式：

脱氢酶活性，以24 h后1 g土壤中释放出的TTCH的微克数表示

TTCH（μg/g）=c×50×ts/m

式中：c—标准曲线上查得的酚浓度，mg/ml；

50—显色液体积，ml； ts—分取倍数； m—土壤质量，g。

5．FDA水解酶活性的测定

试剂

（1）pH 7.6，60 mmol/L磷酸缓冲液；

（2）4.9 mmol/L FDA底物溶液：20 mg FDA底物溶于10 ml丙酮； （3）丙酮；

（4）FDA标准液：称取0.2 g荧光素溶于100 ml无菌的60 mmol/L，pH 7.6磷酸缓冲液中，即为2 mg/ml的母液，然后再取出1 ml定容至10毫升，即为0.2 mg/ml的标准液。 实验方法

（1）操作步骤：取1 g风干土样放入125 ml三角瓶中，加入50 ml，pH 7.6，60 mmol/L的磷酸缓冲液和0.5 ml 4.9 mmol/L的FDA底物溶液，封住三角瓶口，摇动几秒，使反应混合物均匀，后在37 ℃下培养3 h，培养结束后，每瓶立即加入2 ml丙酮，混合均匀以终止FDA水解反应。取30 ml土壤悬浮液，放入50 ml离心管，在8000 g下离心5 min，将滤液转入比色管，在490 nm 波长下比色。 （2）标准曲线的绘制：分别吸取0、0.15、0.5、1.5和2.5 ml的荧光素的标准液，转入50 ml容量瓶，加入一定量的pH 7.6，60mmol/L的磷酸缓冲液，后加入2.5 ml的丙酮，最后定容至50 ml，摇匀后在490 nm波长下比色，绘制标曲。 计算公式：

FDA 水解酶活性活性，以每小时1 g土壤中释放出的FDA的微克数表示

FDA(μg/g)= c×50×ts×1000/（m×t）

式中：c—标准曲线上查得的酚浓度，mg/ml； 50—体积，ml； ts—分取倍数； m—土壤质量，g； t—培养时间。

四、土壤微生物

多样性的实验研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看，大致上包括以下几类：

(1)传统的微生物平板纯培养方法； (2) Biolog微平板分析方法； (3)脂肪酸分析方法； (4)分子生物学方法；

(5)其他方法，如用于微生物生物量测定的氯仿熏蒸方法(Fumigation-incubation )、底物诱导呼吸法(Substrate-induced respiration)和光合微生物色素法等等：用于测定土壤C矿化速率和微生物呼吸强度等方法；用于测定土壤酶活性分析方法；用于土壤微生物形态鉴定的方法；用于测定微生物能量代谢的分析方法；用于测定微生物对土壤养分利用与转化功能的同位素示踪法；以及以荧光为基础的显微技术，包括荧光标记蛋白、荧光染色和荧光原位杂交等。

1．分离与纯化

1、准备

将内装90ml的蒸馏水和玻璃珠若干的三角瓶、已配好的培养基、涂布棒、试管（内装9ml蒸馏水）若干、平皿若干放入高压锅高温灭菌。

配制肉汤蛋白胨固体培养基平板 （1）牛肉膏5g； （2）蛋白胨10g； （3）NaCl 5g； （4）琼脂20g；

（5）自来水1000mL pH 7.5，0.1MPa，121℃来菌20min。 无菌生理盐水

（1）250mL三角瓶中加入99mL 0.9% NaCl （加20个左右的玻璃珠）； （2）250mL三角瓶中加入50mL 0.9% NaCl （作10倍稀释用）。

2、稀释

称取土样1.0g放入盛99mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡5min使土样均匀分散在稀释液中成为土壤悬液（10-2）。用1mL的无菌吸头从中吸取0.5mL土壤悬液注入盛有4.5mL无菌水的试管中，吹吸3次，振荡混匀（10-3）。然后再用同一支1mL吸头，从此管中吸取0.5mL注入另一盛有4.5mL无菌水的试管中（10-4），依此类推制成10-5，10-6，10-7各种稀释度的土壤溶液。

3、涂布平板

将10-5、10-6、10-7的稀释样品分别涂布到已制好的固体培养基平板上，每种涂3个平板。

4、培养

用一支1mL无菌吸头分别从稀释度10-7、10-6和10-5的土壤稀释液中各吸取0.1mL对号放入已写好稀释度的肉汤蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做3个平板。

将平板置于37。C恒温培养三天。

5、分离

从平板中挑取单个菌落进行平板划线分离培养，培养2天，共选了4种菌。 6、纯化

将划线长出的菌接种于已准备好的固体斜面培养基中。培养2天。

7、镜检

对平板中的4种菌分别进行美蓝染色、革兰氏染色、芽孢染色，放在显微镜下观察，并记录结果。

8、保种

将长出菌的斜面放入冰箱中保存。

2．菌株的鉴定的生理生化实验

原理：

（1）糖发酵与氧化试验：在细菌的分类鉴定中，糖类发酵与氧化测定是一项重要依据。特别是对细菌的鉴定尤为重要。常用的发酵与氧化的糖类包括单糖，双糖，多糖三类：如葡萄糖，蔗糖，淀粉等。醇类包括五元醇，六元醇;如到金盏花醇，甘露醇等；糖苷类主要包括有水杨苷等。绝大多数细菌都能利用糖类作为能源和碳源，但由于不同的菌类存在酶类差异，已而对糖类发酵与氧化的能力就有所不同。有的能利用这种而不能利用那种，有的正好相反；有的在糖类发酵与氧化代谢中能分解糖类，产酸产气，有的则只能产酸不能产气。酸产生与否，以及时发酵类型产酸还是氧化类型产酸，可以由预先加在培养基中的指示剂（溴百里酚蓝水溶液）呈现出来。这样把接好菌种的培养基放在厌氧或好样的条件下培养，培养基由绿色变为黄色为产酸，是否产气是通过观察培养基中是否产生气泡或培养基断裂来测定，如产生断裂或有气泡证明由气体存在。

（2）过氧化氢酶测定：乳酸菌和许多厌氧菌与其他细菌区分的主要依据是测定有无过氧化氢酶。过氧化氢酶又称接触酶，它能把过氧化氢分解为水和氧气，氧分子变做气泡跑出来，则为过氧化氢酶阳性。乳酸菌和许多厌氧菌在过氧化氢试验中呈阴性。

（3）细胞色素氧化酶测定：细胞色素氧化酶是氧化酶中的一种，有时人们习惯的把细胞色素氧化酶称为氧化酶，所以在细菌分类鉴定中所说的氧化酶就是指细胞色素氧化酶。细胞色素氧化酶在右分子氧和细胞色素C存在时，可氧化二甲基对本撑二胺(氨基二甲基苯胺)，使之呈现玫瑰红到暗红色，在此基础上，还能和a-苯酚结合生成吲哚酚蓝，而出现蓝色。

实验步骤：

2.1糖类发酵与氧化实验

器具或材料：

试管、接种针、恒温箱等；糖类发酵与氧化实验培养基（半固体）

操作步骤：

百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说教育文库amy土壤整理（采样、测定，微生物）(6)在线全文阅读。