核酸的分离与纯化_百替生物(8)

杂交和PCR反应可以获得很好的结果。

（四）DNA样品的进一步纯化

纯化的方法包括透析、层析、电泳及选择性沉淀等。其中电泳法简单、快速、易于操作、分辨率高、灵敏度好、易于观察及便于回收，在DNA的进一步纯化中占有重要的地位。由于聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）与琼脂糖凝胶（agarose gel）可以制成各种形状、大小和孔径不一的支持体，并可以在多种装置中进行电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）与琼脂糖凝胶电泳（AGE）广泛用于核酸的分离、纯化与鉴定。

二、DNA片段的回收

通过凝胶电泳，我们可以对各种大小与来源的DNA片段进行分离、纯化与鉴定。目前，琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶是最常使用的电泳支持体，电泳分离的DNA处于凝胶的三维网状结构中。下面介绍从琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段的主要方法。

（一）总的原则与要求

无论采用何种方法从何种支持介质中回收DNA片段，都要注意两个原则。一是要提高DNA片段的回收率；二是要去除回收DNA样品中的污染。

回收的DNA样品往往因支持介质的不纯、回收溶液的使用及不慎操作等因素而引入污染，这些污染可能严重影响后继的实验。根据实验要求，应对回收的DNA样品进行纯化，以除去污染物。常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法。其中柱层析法采用阴离子交换层析的原理，主要是利用带负电荷的DNA在低离子强度的缓冲液中与阴离子交换树脂结合，洗去杂质，然后再用高离子强度的缓冲液洗脱下来。上述两种纯化方法以及其它回收DNA片段的方法，最终均要在有盐的情况下进行乙醇沉淀，并以70%的乙醇除去有机分子与共沉淀的盐。

（二）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段

从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法主要包括二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）纤维素膜插片电泳法、电泳洗脱法、冷冻挤压法及低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。

1．DEAE纤维素膜插片电泳法 DEAE纤维素是一种阴离子交换纤维素，可以结合带负电荷的DNA分子。将DEAE纤维素膜插入到经琼脂糖凝胶电泳分离的核酸条带前，

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