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核酸的分离与纯化_百替生物(12)

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仿抽提。

由于条件温和,SDS裂解法有利于大质粒DNA的提取。但该法在处理过程中,有一部分质粒DNA因缠结在细胞碎片上而丢失,故产率不高。

(四)其它方法

其它方法如小量一步提取法、牙签少量制备法及Triton-溶菌酶法等,各有特点与适用范围。小量一步提取法,直接将酚/氯仿与细菌培养物混合,同时完成细胞裂解与蛋白质变性两个过程,然后离心去除大部分胞核DNA与蛋白质,最后从上清中回收质粒DNA。该法简单快速、经济可行,可用于内切酶图谱分析。

(五)质粒DNA的纯化

目前,关于纯化的方法与方案非常多,都利用了质粒相对较小和共价闭环的结构特点。其中,纯化效果好而且适用范围广的方法主要有氯化铯-溴化乙锭等密度梯度超速离心法(简称CsCl-EB法)、聚乙二醇沉淀法和柱层析法。

1.CsCl-EB法 CsCl-EB法是一种沉降平衡离心法,经超速离心,离心介质CsCl形成一连续的密度梯度,在过量EB存在的条件下,各种不同密度的物质经离心平衡后得以

,浮于液面;RNA密度大(2.0g/cm3),分开。其中蛋白质密度小(1.3 g/cm3~1.4g/cm3)

沉于管底;各种DNA密度介于蛋白质与RNA之间,处于中部。过量EB处理前,细菌染色体DNA与不同分子构型的质粒DNA的密度均为1.7g/cm3左右,难以区分。经过量EB处理后,不同分子构型的DNA与EB的结合能力不一样,因而密度下降不一致,可有效分离。其中,闭环质粒DNA为超螺旋三级结构,EB不易插入,结合量少,密度下降小,约为1.59 g/cm3;而染色体DNA、开环质粒DNA以及带切口的环状质粒DNA可以嵌入更多的EB,密度下降较多,约为1.54 g/cm3,从而能与闭环质粒DNA分开。回收的闭环质粒DNA含有嵌入的EB,可采用有机溶剂抽提法或离子交换层析加以去除。经典的CsCl-EB法由于其容量大、分辨率高、纯化效果好,至今仍是质粒DNA纯化的标准方法。但该法很费时并需要昂贵的设备与试剂。

2.聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀法是一种分级沉淀法。质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子RNA,并用RNase消化小分子RNA;然后在高盐条件下,用PEG选择性地沉淀大的质粒DNA;沉淀的质粒DNA进一步用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀。该法简单、经济、适用广,尤其对碱裂解法提取的质粒纯化效果好,

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